[发明专利]一种用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒，包括

—检测引物溶液：由浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅰ、浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅱ、浓度为32~48 μmol/L的内引物Ⅰ和浓度为32~48μmol/L的内引物Ⅱ配制而成；

—具有链置换活性的Bst DNA聚合酶：浓度为7~9U/μL；

—10×反应缓冲液： 200 mmol/L且pH= 8.8的Tris-HCl，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH₄)₂SO₄，40~100 mmol/L MgSO₄，6~14 mol/L 甜菜碱； 

—dNTPs 溶液：由浓度分别为10 mmol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；

—阳性 DNA 对照样品：含有脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的大肠杆菌质粒 DNA，或者食品中常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼的总DNA样品；

—阴性 DNA 对照样品：不含脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的 DNA；

—显色剂：1000×SYBR GREEN I 荧光染料。

2.如权利要求1所述的一种用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒，其特征在于：所述脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1第1位到259位所示。

3.如权利要求1所述的一种用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒，其特征在于：所述外引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2第1位到18位所示。

4.如权利要求1所述的一种用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒，其特征在于：所述外引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3第1位到18位所示。

5.如权利要求1所述的一种用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒，其特征在于：所述内引物Ⅰ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4第1位到44位所示。

6.如权利要求1所述的一种用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒，其特征在于：所述内引物Ⅱ的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5第1位到46位所示。

7.如权利要求1所述的一种用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒的检测方法，包括以下步骤：

⑴按常规方法提取待测样品DNA；

⑵配制待测样品的 LAMP 检测反应体系：

在 200 μL PCR反应管Ⅰ内加入所述待测样品DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；

⑶配制对照样品的LAMP检测反应体系：

在 200 μL PCR反应管Ⅱ内加入阳性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；

在 200 μL PCR反应管Ⅲ内加入阴性 DNA 对照样品2~5 μL、检测引物溶液1.5μL、Bst DNA聚合酶1μL、10×反应缓冲液2.5μL、dNTPs 溶液 3 μL，用灭菌去离子水补齐到 25 μL；

⑷分别对所述PCR反应管Ⅰ、PCR反应管Ⅱ、PCR反应管Ⅲ进行LAMP扩增反应：60~65℃孵育20~60min，80℃孵育5min终止反应；

⑸LAMP 扩增结果的鉴定：在LAMP扩增产物中加入1~2 μL 显色剂，混匀，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果；当出现绿色，则为阳性，即判定样品中含有动物源性成分；当出现橙色，则为阴性，即判定样品中不存在动物源性成分。