[发明专利]一种用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒及其检测方法有效

专利信息
申请号: 201410637173.4 申请日: 2014-11-13
公开(公告)号: CN104328195A 公开(公告)日: 2015-02-04
发明(设计)人: 臧荣鑫;徐红伟 申请(专利权)人: 西北民族大学
主分类号: C12Q1/68 分类号: C12Q1/68
代理公司: 兰州中科华西专利代理有限公司 62002 代理人: 李艳华
地址: 730030 甘*** 国省代码: 甘肃;62
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摘要:
搜索关键词: 一种 用于 饲料 动物 成分 检测 试剂盒 及其 方法
【说明书】:

技术领域

发明涉及一种检测试剂盒,尤其涉及一种用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒及其检测方法。

背景技术

饲料安全隐患会导致食品安全问题,危害人类健康,不利于社会稳定,与动物生产、环境污染和人类健康密切相关,己成为全球关注的热点问题。近年来,受饲料原料和饲料添加剂污染的食品曝光事件不断,随着饲料安全问题引发的动物源性食品安全事件此起彼伏,爆发一系列危害人类健康和生命安全事件。疯牛病就是其中危害性很大的一个,目前尚无方法治疗,为了阻断“疯牛病”通过养殖生产环节传播,消除使用动物源性饲料可能带来的安全隐患,许多国家和地区相继出台相关饲料法规条例以规范饲料行业,禁止在反刍动物饲料中使用动物源性蛋白饲料。

我国尚未发现疯牛病,但在防范疯牛病方面也作了大量的努力和工作。1992 年发布《关于禁止用反刍动物源性饲料喂反刍动物的通知》;1999 年发布《关于加强对进口饲用油脂和动物性饲料经营和使用管理的通知》;2000 年发布《关于加强肉骨粉等动物性饲料产品管理的通知》;2001 年为更好地防止疯牛病进入我国,农业部又相继发布了《关于办理动物性饲料产品进口登记有关问题的通知》、《关于加强疯牛病防治工作的通知》、《关于禁止在反刍动物饲料中添加和使用动物性饲料的通知》和关于防止疯牛病的公告;2004 年 10 月农业部以部令的形式颁布《动物源性饲料产品安全卫生管理办法》。

国内外众多学者也对动物源性饲料的检测技术进行了大量的研究,目前主要以样品的组织学特性和品种特异性的生物标记物,如蛋白质、DNA 和其他生物大分子等为对象检测饲料中动物源性成分。以组织学为基础的检测技术,存在耗时,同时要求操作者有相当的实际操作经验来区分哺乳动物骨片。如骨粉中仍有细胞(造骨细胞和骨细胞)存在,利用显微技术能够区分单一

骨骼片断,但无法区分动物来源;结果具有一定的主观性;尽管能够检出微

量的动物源性成分,但通常不能区分动物种类或品种;设备要求高,以电镜作为常规分析费用太高。以蛋白质为基础的分析方法,需要分离品种特异性的蛋白,过程比较繁琐,同时品种接近的蛋白间能够发生交叉反应,甚至来自其它品种的微量蛋白常常能够掩盖品种特异性的条带,因此会产生假阳性结果。

线粒体DNA具有分子量小、拷贝数多和结构稳定等特点,是动物性外源成分鉴定和物种分类等技术的理想靶基因。饲料中牛、羊、猪、鸡、鱼等动物成分的检测主要是通过线粒体基因组特异序列来进行检测的。现有关于动物源性饲料检测方法存在耗时和效率低等问题。

本发明从GenBank中检索对常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼等物种已公布的线粒体全基因组序列,并进行序列比对分析发现一段仅存在于脊椎动物,而在细菌、古菌、真菌和绿色植物线粒体中不存在的高度保守DNA序列,用于饲料中动物源性成分的检测。

因此,建立快速、灵敏、可靠的动物源性饲料检测技术,对于提高饲料质量、防止饲料掺假、控制进口饲料安全和制订相关饲料法规等均具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、高效的用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒。

本发明所要解决的另一个技术问题是该用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒的检测方法。

为解决上述问题,本发明所述的一种用于饲料中动物源性成分检测的试剂盒,包括

—检测引物溶液:由浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅰ、浓度为4~6 μmol/L的外引物Ⅱ、浓度为32~48 μmol/L的内引物Ⅰ和浓度为32~48μmol/L的内引物Ⅱ配制而成;

—具有链置换活性的Bst DNA聚合酶:浓度为7~9U/μL;

—10×反应缓冲液: 200 mmol/L且pH= 8.8的Tris-HCl,100 mmol/L KCl,100 mmol/L (NH4)2SO4,40~100 mmol/L MgSO4,6~14 mol/L 甜菜碱; 

—dNTPs 溶液:由浓度分别为10 mmol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成;

—阳性 DNA 对照样品:含有脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的大肠杆菌质粒 DNA,或者食品中常见的猪、牛、羊、鸡、鸭和鱼的总DNA样品;

—阴性 DNA 对照样品:不含脊椎动物线粒体高度保守DNA序列的 DNA;

—显色剂:1000×SYBR GREEN I 荧光染料。

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