[发明专利]一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的引物及方法

说明书

本申请是申请号为201310129302.4、申请日2013年4月12日的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种用于检测H7N9禽流感病毒的试剂盒。

背景技术

流感病毒属于正粘病毒科( orthomyxoviridae) ，有包膜、分节段基因组的单负链RNA 病毒。根据核蛋白和包膜内侧面的M1 蛋白的抗原性将流感病毒分甲( A) 、乙( B) 、丙( C) 三型。甲型流感病毒再根据包膜表面血凝素( hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶( neuraminidase，NA) 两种刺突的抗原性分若干亚型，目前包括H1 ～ H16 亚型，NA包括N1 ～ N9 亚型。所有人类的流感病毒都可以引起禽类流感，但不是所有的禽流感病毒都可以引起人类流感，禽流感病毒中，H3、H5、H7、H9可以传染给人，其中H5为高致病性。H3为人犬共患，依据流感病毒特征可分为HxNx共135种亚型，H7N9亚型禽流感病毒是其中的一种。这个病毒的生物学特点、致病力、传播力，还没有依据进行分析判断。

H7N9亚型禽流感病毒是甲型流感中的一种，既往仅在禽间发现，未发现过人的感染情况。但我国人感染H7N9禽流感于2013年3月底在上海和安徽两地率先发现。H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型流感病毒，尚未纳入我国法定报告传染病监测报告系统，并且至2013年4月初尚未有疫苗推出。

中国国家卫生和计划生育委员会2013年3月3日印发人感染H7N9禽流感诊疗方案、防控方案及医院感染预防与控制技术指南。根据人感染H7N9禽流感诊疗方案（2013年第1版），人感染H7N9禽流感传染源目前尚不明确，根据以往经验及本次病例流行病学调查，推测可能为携带H7N9禽流感病毒的禽类及其分泌物或排泄物。传播途径为经呼吸道传播，也可通过密切接触感染的禽类分泌物或排泄物等被感染，直接接触病毒也可被感染。现尚无人与人之间传播的确切证据。现阶段高危人群主要是从事禽类养殖、销售、宰杀、加工业者，以及在发病前1周内接触过禽类者。 诊疗方案指出，人感染H7N9禽流感潜伏期一般为7天以内。患者一般表现为流感样症状，如发热，咳嗽，少痰，可伴有头痛、肌肉酸痛和全身不适。重症患者病情发展迅速，表现为重症肺炎，体温大多持续在39℃以上，出现呼吸困难，可伴有咯血痰；可快速进展出现急性呼吸窘迫综合征、纵隔气肿、脓毒症、休克、意识障碍及急性肾损伤等。

根据流行病学接触史、临床表现及实验室检查结果，可作出人感染H7N9禽流感的诊断。在流行病学史不详的情况下，根据临床表现、辅助检查和实验室检测结果，特别是从患者呼吸道分泌物标本中分离出H7N9禽流感病毒，或H7N9禽流感病毒核酸检测阳性，可以诊断。

发明内容

鉴于核酸检测是直接检测病原体核酸，具有高敏感，高特异和短检测窗口期等优点，为疫病早诊断、早治疗、降低病死率以及控制疫情争取时间。本发明提供了一种实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，用于检测H7N9禽流感病毒核酸。

一种利用实时荧光定量PCR检测H7N9禽流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

(1) RNA提取试剂、逆转录试剂、实时荧光定量PCR扩增反应试剂；

(2) 用于扩增样本cDNA的引物及探针，包括：

检测H7N9禽流感病毒包膜表面血凝素H7的引物及探针：

H7-F: GGGWTTCACMTACAGYGGAATAAG

H7-R: ACAGGARCCATTTCATCTCYGC

H7-probe: FAM-CAACSAGTGCATGTAGGAGATCAGGWTCTTC-TAMARA

      检测H7N9禽流感病毒神经氨酸酶N9的引物及探针：

N9-F: TGARTGCAGGTTCTATGCTCTCA

N9-R: TGTATACTGTGGGYGGTGATGA

N9-Probe: HEX-CTCAAACGGAACAATACACGATAGGTCCCA-TAMARA。

进一步地，所述RNA提取试剂包括QIAamp Viral RNA mini Kit；所述逆转录试剂包括5×RT-Buffer，100uM Primer Mix，100U/ul ReverTra Ace逆转录酶和DEPC水；所述实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括qPCR Mix，50×ROX，扩增引物及探针和灭菌水。

更进一步地，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：