[发明专利]一种致病疫霉的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种致病疫霉的LAMP检测引物组合物及其LAMP检测试剂盒和LAMP检测方法。

背景技术

致病疫霉(Phytophthora infetans)是疫霉属发现的第一个种，能够引起马铃薯晚疫病，主要侵染马铃薯、番茄等多种农作物，造成严重减产甚至绝收。马铃薯晚疫病是导致马铃薯块茎腐烂和茎叶死亡的一种毁灭性卵菌病害，是严重影响马铃薯产量、品质和产业化发展的世界性病害，1847年在爱尔兰曾因该病的大发生使马铃薯歉收而导致大饥荒。致病疫霉一直是马铃薯和番茄生产上的最严重的病害之一，近年来，马铃薯晚疫病在我国有逐年加重的趋势，其危害性、防治难度及对社会造成的影响已经超过了水稻稻瘟病和小麦条锈病，被视为世界第一大作物病害，特别是近年来由于抗病品种的推广、交配型的出现以及病菌的迁移，新的基因型群体取代了旧的基因型群体，形成了更具侵染力和适合度更高的生理小种，使得晚疫病的控制异常困难，其危害也越来越严重，因此应该引起高度重视。为了阻止致病疫霉传播范围的不断扩大，使致病疫霉引起的晚疫病得到控制，需要对其进行快速、准确地检测。

传统的致病疫霉的分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统方法在致病疫霉检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉分离、形态学鉴定知识和丰富的经验。随着核酸相关的鉴定方法的发展，PCR技术为植物病原诊断提供了快速、灵敏、准确的优势，虽然PCR法在特异性和敏感性上有较大的提高，但是检测时间仍然比较长，大概4～5h，同时PCR方法依赖精密的温度循环装置。其检测灵敏度比较高，但是检测过程复杂，不能满足快速检测的需求。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本的荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术，因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点，成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60～65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求，检测成本大大降低。由于LAMP反应简单、快速、高效、经济等特征，因而具有极为广泛的应用前景。自LAMP检测技术建立14年以来，该技术已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究，但在植物病原卵菌的检测报道很少，致病疫霉菌的检测国内外均未见报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术中致病疫霉生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低的问题，本发明的目的是提供一种致病疫霉菌的LAMP检测引物组合物。本发明的另一目的是提供上述致病疫霉菌的LAMP检测试剂盒。本发明还有一目的是提供上述致病疫霉菌的LAMP检测方法。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于检测致病疫霉菌的LAMP检测引物组合物：由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LB组成；各引物序列具体如下：

FIP：5′-AATCGCGAAAGCCATGTGAGCCAAACGACCTTTTGTAAGG-3′；

BIP：5′-TTGCTTAGAAAATCCGTACGATCGGACAAATGTTTTTTTAGCGGC-3′；

F3：5′-TGTGAGTGTCTAACATATTTTACG-3′；

B3：5′-GTTAGTTAAATAGGAAATCACGC-3′；

LB：5′-GGCAAGACCATCAAGCTCCAA-3′。

所述的LAMP检测引物组合物在检测致病疫霉菌的中的应用。