[发明专利]一种马秋波病毒非诊断性的免疫学检测方法

权利要求书

1.一种马秋波病毒非诊断性的免疫学检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)根据马秋波病毒基因序列的S片段设计特异性引物；

(2)以马秋波病毒的RNA为模板，加入所述特异性引物，经逆转录合成cDNA，并以所述cDNA为模板，利用PCR扩增马秋波病毒S片段上的开放阅读框架，经酶切、纯化，得到PCR产物；

(3)将上述PCR产物与TOPO质粒连接，从而构建重组质粒pET100，并在大肠杆菌的化学感受态细胞中进行质粒的转化，培养，经菌落PCR筛选出阳性克隆；

(4)将所述阳性克隆接种到新鲜的LB培养基中，培养后分离出转化后的质粒，经IPTG诱导表达，以收集的目的蛋白作为抗原，采用免疫学检测方法检测待测样本中是否含有马秋波病毒；

其中，步骤(1)中设计的所述特异性引物的序列为：

上游引物NP of Machupo virus-F：

5'-TTACAGTGCAAAGGCTGCCTTGGGTAGAAATAGAA-3'；

下游引物NP of Machupo virus-R：

5'-TGGCTCACTCCAAGGAAATTCCCAGCTTTCGGTGGACTCA-3'。

2.根据权利要求1所述的免疫学检测方法，其特征在于，所述免疫学检测方法为间接ELISA。

3.根据权利要求1所述的免疫学检测方法，其特征在于，步骤(2)中PCR的条件为：反应体系为：

反应条件为：

4.根据权利要求1所述的免疫学检测方法，其特征在于，步骤(3)中PCR产物与TOPO质粒连接的条件为：

冰上轻轻混匀，室温孵浴5min，冰上连接反应。

5.根据权利要求1所述的免疫学检测方法，其特征在于，步骤(3)菌落PCR的条件如下：

反应条件：

6.根据权利要求1所述的免疫学检测方法，其特征在于，步骤(4)中所述诱导表达的步骤包括：

(1)在若干支已高压灭菌的试管里分别倒入含100mg·ml^-1氨苄西林的LB培养液3～4ml；

(2)用记号笔圈出长得比较圆润且单一的工程菌落，镊子轻挑，放入分装好的试管里；

(3)摇床225rpm，37℃培养2h；

(4)取上述培养液按1:500比例接种到新鲜的LB培养液，225rpm，37℃培养大约4h后测且OD₆₀₀值为0.585，再加入IPTG至终浓度为1mM开始诱导，诱导产物经后经后续步骤分离出目的蛋白。