[发明专利]一种马秋波病毒非诊断性的免疫学检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒检测领域，具体地涉及一种马秋波病毒的免疫学检测方法。

背景技术

马秋波病毒(machupo virus，MACV)属于沙粒病毒属(Arenavirus)，有包膜，毒粒呈多型性，大小为80～150nm。1963年首次在玻利维亚委内瑞拉暮鼠(Calomys callosus)中分离到的。病毒基因组为单负链RNA双环，分节段(L段和S段)，细胞质内复制。几乎所有的沙粒病毒都能引起啮齿类动物持续性感染。马秋波病毒被视为沙粒病毒属中新世界病毒的代表之一。它与胡宁病毒(Junin)、瓜纳里托病毒(Guanarito)是引起人出血热重要病毒，主要症状表现为发烧、乏力、肌肉酸痛、厌食等，3～4天后会伴随头痛头晕、恶心和严重衰竭，潜伏期在1～2周，其高致病性和致死率不低于30％。

虽然，我国还未发现感染马秋波病毒的病例存在，但是随着全球经济一体化和贸易自由化，国外的医学媒介生物通过先进的交通工具和国际贸易，可以迅速把传染病从一个国家或地区传向全球，造成国际间传播。传染病在国际间的广泛传播与流行，已成为各国政府密切关注的政治问题。《国际卫生条例》、《中华人民共和国卫生检疫法》、都对传染病风险预警与快速决策做出了相应的规定。我国已将传染病防控提升到战略的角度，予以高度重视。

本发明选取马秋波病毒的基因序列的S片段，通过大肠杆菌表达系统表达马秋波病毒基因的目的蛋白，继而通过免疫学方法对马秋波病毒进行检测，对科研和社会卫生安全具有重大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种马秋波病毒的非诊断性检测免疫学检测方法。该方法包括具体如下步骤：

(1)根据马秋波病毒基因序列的S片段设计特异性引物；

(2)以马秋波病毒的RNA为模板，加入所述特异性引物，经逆转录合成cDNA，并以所述cDNA为模板，利用PCR扩增马秋波病毒S片段上的开放阅读框架，经酶切、纯化，得到PCR产物；

(3)将上述PCR产物与TOPO质粒连接，从而构建重组质粒pET100，并在大肠杆菌的化学感受态细胞中进行质粒的转化，培养，经菌落PCR筛选出阳性克隆；

(4)将所述阳性克隆接种到新鲜的LB培养基中，培养后分离出转化后的质粒，经IPTG诱导表达，以收集的目的蛋白作为抗原，采用免疫学检测方法检测待测样本中是否含有马秋波病毒；

其中，步骤(1)中设计的所述特异性引物的序列为：

上游引物NP of Machupo virus-F：

5'-TTACAGTGCAAAGGCTGCCTTGGGTAGAAATAGAA-3'；

下游引物NP of Machupo virus-R：

5'-TGGCTCACTCCAAGGAAATTCCCAGCTTTCGGTGGACTCA-3'。

进一步地，所述免疫学检测方法为间接ELISA。

进一步地，步骤(2)中所述PCR的反应物为：

反应条件为：

进一步地，步骤(3)中PCR产物与TOPO质粒连接的条件为：

冰上轻轻混匀，室温孵浴5min，冰上连接反应。

进一步地，步骤(3)中菌落PCR的反应物如下：

反应条件：

进一步地，步骤(4)中阳性克隆培养、诱导表达的步骤为：

(1)在若干支已高压灭菌的试管里分别倒入含100mg·ml^-1氨苄青霉素的LB培养液3～4ml；

(2)用记号笔圈出长得比较圆润且单一的工程菌落，镊子轻挑，放入分装好的试管里；

(3)摇床225rpm，37℃培养2h；

取上述培养液按1:500比例接种到新鲜的LB培养液，225rpm，37℃培养大约4h后测且OD₆₀₀值为0.585，再加入IPTG至终浓度为1mM开始诱导，诱导产物经后经后续步骤分离出目的蛋白。

有益效果

本发明通过提取病毒RNA，选取病毒基因的S片段，并设计出较长的特异性引物序列，经PCR扩增，构建重组质粒，在大肠杆菌内准确表达出目的蛋白，将目的蛋白作为抗原进行免疫学检测，实现了对马秋波病毒的可靠而有效的检测。此外，本发明采用了优化的诱导表达条件，不仅利于提高目的蛋白的产量，还利于目的的分离和检测。

附图说明

图1是马秋波病毒核蛋白(NP)扩增鉴定图；