[发明专利]整合子In1069

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术及耐药细菌监测领域，涉及一种新发现的与大肠杆菌耐药性密切相关的整合子In1069。

背景技术

大肠杆菌是典型的革兰氏阴性杆菌，其引起的大肠杆菌病是一种常见疾病。大肠杆菌病的主要防治措施是应用疫苗和抗生素。但是随着抗生素的广泛、持续及不当应用，大肠杆菌耐药谱不断扩大、耐药水平不断提高，大肠杆菌耐药及多重耐药现象已十分严重，给畜牧业的发展和人类健康带来潜在的危害。

整合子(integron)是一个能通过自身编码的整合酶识别、捕获、整合或剪切细胞外游离基因或基因片段，并使之转化为功能性基因的重组表达系统。整合子依据整合酶序列的不同可分成多种不同的类型。I类整合子至今发现在革兰阴性菌中广泛分布、检出率最多。I类整合子的基本结构由3部分组成,两端是高度保守序列,分别称作5’保守端(5’-CS)和3’保守端(3’-CS),5’-CS长约1.4kb，3’-CS长约2kb，5’-CS和3’-CS之间的区域称作可变区，可变区由一个或多个基因盒组成，基因盒一般含抗菌药物耐药基因。整合子是一种可移动的基因元件，位于细菌的质粒或染色体上，可携带多个抗菌药物耐药基因，并能引起耐药基因的高效、快速转移，造成同种或不同菌种之间的扩散，从而表达对不同抗生素的多重耐药性。

临床抗菌药物大量应用是细菌整合子分子进化和捕获更多耐药基因的重要原因,故应加强抗菌药物的合理应用,以减少整合子发生、分子进化的外部诱导环境,延缓多药耐药菌株的发生。

发明内容

本发明提供了一种含有耐药基因盒的整合子，将其命名为In1069，其序列如SEQ ID NO.1所示。该整合子含有aacA4’-3基因盒、bla_IMP-1基因盒。上述整合子导致含有该整合子的菌株EC6335对多种抗生素药物具有抗性。这些抗生素包括：氨基糖苷类抗生素、β-内酰胺类抗生素。

常见的氨基糖苷类抗生素包括：链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、阿米卡星。

常见的β内酰胺类抗生素包括：青霉素、头孢菌素、碳青霉烯类，以及新发展的头霉素类、硫霉素类、单环β-内酰胺类等其他非典型β-内酰胺类抗生素。

本发明的整合子是通过以下方法获得的：

(1)在台州市立医院重症监护室病人脓液培养阳性的标本中分离出1株对头孢吡啶、亚胺培南耐药的细菌；

(2)然后将分离的单克隆菌株按操作程序用VITEK 2和药敏平板琼脂扩散方法(补充药敏纸片)进行细菌鉴定及药敏试验，经鉴定此菌株为大肠杆菌，将其命名为EC6335；同时，试验证实此菌株对多种抗生素有显著抗性；所述抗生素为氨曲南、阿米卡星、妥布霉素、丁胺卡拉、庆大霉素、头孢替坦、头孢唑林、头孢吡肟、头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦(舒普深)；

(3)将EC6335菌株培养扩增，提取所述耐药菌株的质粒；

(4)扩增经步骤(3)获得的质粒上的DNA片段，测序；

(5)利用ContigExpress Program软件进行序列拼接，分析其结构，鉴定出序列如SEQ ID NO.1所示的整合子。

进一步，步骤(4)的具体操作步骤如下：以步骤(3)获得的质粒为模板，利用表1中的引物进行DNA片段扩增：

表1引物序列

注：*RP表示复制蛋白基因；*HP表示假定蛋白基因；*RIP表示复制启动蛋白基因

将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收所有扩增出的片段，以常规方法将扩增片段分别与pMD19-T载体连接，然后热激转化法转入感受态细胞E.coli TOP10中，以蓝白斑实验挑选阳性转化子，测序。

本发明还提供了一种含有整合子In1069序列的重组质粒。所述质粒包含整合子In1069序列。在本发明的具体的实施方案中，所述重组质粒由整合子In1069序列和pET32a载体重组而成，整合子插入位点在pET32a载体上BamHI酶切位点处。所述重组质粒使用的空载体可以使用任何常见的质粒载体代替。所述重组质粒的方法也为本领域技术人员熟知的常规方法。