[发明专利]两个DNA片段一步PCR融合的方法

权利要求书

1.两个DNA片段一步PCR融合的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1、获取DNA1片段、DNA2片段模板及DNA1片段的第一上游引物U1、第一下游引物L1、DNA2片段的第二上游引物U2、第二下游引物L2；

步骤2、对步骤1中得到的DNA1片段以第一上游引物U1、第一下游引物L1为引物，DNA2片段以第二上游引物U2、第二下游引物L2为引物，在PCR仪中进行PCR一步扩增得到融合DNA片段。

2.根据权利要求1所述的两个DNA片段一步PCR融合的方法，其特征在于，所述步骤2中进行PCR一步扩增的具体步骤为：

步骤2.1、对步骤1中得到的DNA1片段以第一上游引物U1、第一下游引物L1为引物，以及DNA2片段以第二上游引物U2、第二下游引物L2为引物，按照第一PCR反应体系及第一PCR扩增反应参数进行PCR扩增反应，分别得到DNA1与DNA2单个靶标分子，然后再通过第二PCR扩增反应参数进行PCR扩增反应，得到DNA1与DNA2靶标分子的融合片段；

步骤2.2、对步骤2.1中得到的DNA1与DNA2靶标分子的融合片段按照第二PCR反应体系及第三PCR扩增反应参数进行PCR扩增反应，即获得了DNA1片段与DNA2片段的融合基因片段。

3.根据权利要求2所述的两个DNA片段一步PCR融合的方法，其特征在于，所述步骤2.1中的第一PCR反应体系由2-5μL的10倍浓度的缓冲液、2-4μL的dNTP、1-2μL的摩尔浓度为10-25nM的第一上游引物U1、1-2μL的摩尔浓度为10-25nM的第一下游引物L1、1-2μL的摩尔浓度为10-25nM的第二上游引物U2、1-2μL的摩尔浓度为10-25nM的第二下游引物L2、0.5-1μL的DNA1片段、0.5-1μL的DNA2片段、0.5-1μL的2U/μL的Taq DNA聚合酶及5.5-36.5μL的ddH₂O组成。

4.根据权利要求2所述的两个DNA片段一步PCR融合的方法，其特征在于，所述步骤2.1中的第一PCR扩增反应参数为：在94-96℃的温度下预变性5-10min，然后在94-96℃的温度下变性60-90s、37-72℃的温度下退火30-90s、72℃的温度下延伸40-120s并将此3个步骤循环5次，最后再在72℃的温度下延伸5-10min。

5.根据权利要求2所述的两个DNA片段一步PCR融合的方法，其特征在于，所述步骤2.1中的第二PCR扩增反应参数为：在94-96℃的温度下预变性5-10min，然后在94-96℃的温度下变性60-90s、37-72℃的温度下退火30-90s、72℃的温度下延伸40-120s并将此3个步骤循环5次，最后再在72℃的温度下延伸5-10min。

6.根据权利要求2所述的两个DNA片段一步PCR融合的方法，其特征在于，所述步骤2.2中的第二PCR反应体系由2-5μL的10倍浓度的缓冲液、2-4μL的dNTP、1-2μL的摩尔浓度为5-10μM的第一上游引物U1、1-2μL的摩尔浓度为5-10μM的第二下游引物L2、0.5-1μL的2U/μL的Taq DNA聚合酶及6-36.5μL的ddH₂O组成。

7.根据权利要求2所述的两个DNA片段一步PCR融合的方法，其特征在于，所述步骤2.2中的第三PCR扩增反应参数为：在94-96℃的温度下预变性5-10min，然后在94-96℃的温度下变性60-90s、37-72℃的温度下退火30-90s、72℃的温度下延伸40-120s并将此3个步骤循环30次，然后再在72℃的温度下延伸5-10min，最后一直在2-6℃下保存。

8.根据权利要求1-7任一项所述的两个DNA片段一步PCR融合的方法，其特征在于，所述DNA1片段及所述DNA2片段中的靶标片段的长度为200-1000个碱基对。