[发明专利]两个DNA片段一步PCR融合的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种两个DNA片段一步PCR融合的方法。

背景技术

传统的基因片段的重组构建以限制性内切酶和DNA连接酶为基础，通过一系列的酶切连接反应将各片段逐步连接起来。这种方法费时费力，不但在连接过程中引入了不必要的酶切位点碱基序列，而且对于过长片段连接有时难以找到合适的酶切位点，过短的片段又增加了连接和鉴定的难度。为了克服传统的重组构建方法的缺陷，出现了以聚合酶链式反应为基础的片段拼接技术——融合PCR技术。但其在应用过程中还有很多方面需要改进，如首先必须应用特异性引物，对各片段进行独立扩增、分别纯化、回收才能进行融合扩增；一般要进行两步PCR反应，延长了实验时间，增加了实验成本及操作程序等。

发明内容

本发明的目的是提供一种两个DNA片段一步PCR融合的方法，解决了现有酶切技术中存在的费时费力、在连接过程中引入了不必要的酶切位点碱基序列及PCR技术反应步骤繁琐、时间长的问题。

本发明所采用的技术方案是，本发明两个DNA片段一步PCR融合的方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1、获取DNA1片段、DNA2片段模板及DNA1片段的第一上游引物U1、第一下游引物L1、DNA2片段的第二上游引物U2、第二下游引物L2；

步骤2、对步骤1中得到的DNA1片段以第一上游引物U1、第一下游引物L1为引物，DNA2片段以第二上游引物U2、第二下游引物L2为引物，在PCR仪中进行PCR一步扩增得到融合DNA片段。

本发明的特点还在于，

步骤2中进行PCR一步扩增的具体步骤为：

步骤2.1、对步骤1中得到的DNA1片段以第一上游引物U1、第一下游引物L1为引物，以及DNA2片段以第二上游引物U2、第二下游引物L2为引物，按照第一PCR反应体系及第一PCR扩增反应参数进行PCR扩增反应，分别得到DNA1与DNA2单个靶标分子，然后再通过第二PCR扩增反应参数进行PCR扩增反应，得到DNA1与DNA2靶标分子的融合片段；

步骤2.2、对步骤2.1中得到的DNA1与DNA2靶标分子的融合片段按照第二PCR反应体系及第三PCR扩增反应参数进行PCR扩增反应，即将DNA1片段与DNA2片段进行了融合。

步骤2.1中的第一PCR反应体系由2-5μL的10倍浓度的缓冲液、2-4μL的dNTP、1-2μL的摩尔浓度为10-25nM的第一上游引物U1、1-2μL的摩尔浓度为10-25nM的第一下游引物L1、1-2μL的摩尔浓度为10-25nM的第二上游引物U2、1-2μL的摩尔浓度为10-25nM的第二下游引物L2、0.5-1μL的DNA1片段、0.5-1μL的DNA2片段、0.5-1μL的2U/μL的Taq DNA聚合酶及5.5-36.5μL的ddH₂O组成。

步骤2.1中的第一PCR扩增反应参数为：在94-96℃的温度下预变性5-10min，然后在94-96℃的温度下变性60-90s、37-72℃的温度下退火30-90s、72℃的温度下延伸40-120s并将此3个步骤循环5次，最后再在72℃的温度下延伸5-10min。

步骤2.1中的第二PCR扩增反应参数为：在94-96℃的温度下预变性5-10min，然后在94-96℃的温度下变性60-90s、37-72℃的温度下退火30-90s、72℃的温度下延伸40-120s并将此3个步骤循环5次，最后再在72℃的温度下延伸5-10min。

步骤2.2中的第二PCR反应体系由2-5μL的10倍浓度的缓冲液、2-4μL的dNTP、1-2μL的摩尔浓度为5-10μM的第一上游引物U1、1-2μL的摩尔浓度为5-10μM的第二下游引物L2、0.5-1μL的2U/μL的Taq DNA聚合酶及6-36.5μL的ddH₂O组成。

步骤2.2中的第三PCR扩增反应参数为：在94-96℃的温度下预变性5-10min，然后在94-96℃的温度下变性60-90s、37-72℃的温度下退火30-90s、72℃的温度下延伸40-120s并将此3个步骤循环30次，然后再在72℃的温度下延伸5-10min，最后一直在2-6℃下保存。

DNA1片段及DNA2片段中的靶标片段的长度为200-1000个碱基对。