[发明专利]一种重金属低积累的转基因植物的培育方法

说明书

技术领域

本发明涉及转基因植物的培育，具体地说，涉及一种重金属低积累的转基因植物的培育方法。

背景技术

在我国，随着工农业生产的发展，土壤重金属污染问题已经越来越突出。土壤是植物生长需要营养物质的储存库，因而土壤中重金属元素含量的多少在很大程度上决定了农作物受污染的程度。重金属污染农田的治理是目前国际上难点和热点研究领域之一。科学家们利用固定、过滤、离子交换及不溶化固定等多种理化学方法，试图净化重金属污染的土壤，但这些技术的应用需要高价的装备和技术。况且像农耕土壤一样，污染轻微且污染面积大的地方很难实际应用。近几年，对于重金属污染农田治理的研究工作主要集中在用于植物修复的超级累植物筛选，这些植物大部分是野生的，生长速度慢，生物量低，修复时间长，田间应用存在不确定性和种植难度。实际生产中投入到重金属污染土壤中的超积累植物的净化效果远不如实验室条件下取得的效果。鉴于我国实际国情，将大面积中-轻度污染的农田停止农作，进行长时间的植物修复或其它成本昂贵工程修复显然是不现实的。2006S.Herbette等人提出了污染安全的品种pollution-safe cultivars(PSCs)的概念。即生长在受污染的土壤，特定污染物在食用部分的积累水平足够低，符合质量标准，可供安全食用的品种。面对农田资源的日趋减少和土壤重金属镉污染愈加严重的现状，筛选和培育低吸收、低积累土壤中重金属的作物基因型，特别是利用基因工程培育低量积累重金属的作物品种已成为保障农产品安全生产的主要研究方向。近年来，污染安全品种吸引了研究者和育种公司更大的关注和兴趣。

大多数重金属是植物非必需的微量元素，对植物有很强的毒性。超过一定的量会抑制植物细胞生长，抑制氧化磷酸化，引发氧化胁迫，影响光合作用，损伤核仁和影响质膜ATP酶的活力。一些植物通过诱导形成螯合肽、金属硫蛋白、植物应激蛋白等抵御重金属毒害，也有的植物则通过细胞壁固定、液泡分隔、腺体分泌等途径来抵御毒害。植物的代谢产物与重金属形成复合体后储藏在细胞内的液泡中，抑制毒性发作。

基因是决定植物对土壤重金属吸收积累特性的最重要因素，低积累植物对重金属的排斥机制通常认为包括两个方面，一是减少根部对重金属的吸收；二是重金属在根部通过区室化保存，从而限制向地上部转移。但植物耐受、转运和富集镉是一个复杂的过程，涉及转运蛋白家族、螯合蛋白家族、抗氧化系统等多个方面的参与。目前，植物中可以应用于遗传改良基因工程的，对重金属排斥机制其主要的金属转运蛋白和关键调控因子仍未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种重金属低积累的转基因植物的培育方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种重金属低积累的转基因植物的培育方法，包括如下步骤：

(1)重组表达载体的构建：

将酵母Ycf1p基因克隆到农杆菌植物双元表达载体上，在限制性内切酶的作用下连接含有Prp1启动子的T载体，得到在Prp1启动子驱动下表达Ycf1p基因的表达载体；

(2)转基因植株的构建：

将所得表达载体转入植物愈伤组织中，用含诱导剂和农杆菌的培养液进行转化，转化后的材料经过共培养-筛选-分化-生根-转基因苗的锻炼和移栽，筛选转基因阳性植株；

其中，所述酵母Ycf1p基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，Prp1启动子的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

进一步地，所述步骤(1)具体为：

用内切酶SacI与SalI将Ycf1p克隆到中间载体pGEM-5Z上得到pYcf1p-5Z，将pYcf1p-5Z用SalI和SpeI酶切后，回收Ycf1p基因片段，再经T4连接酶连接到经SalI和SpeI酶切后的植物表达载体pCAMBIA1301上，再由BamHI酶切表达载体pCAMBIA1301和含有Prp1启动子的T载体，连接后得到在根表皮细胞膜特异启动子Prp1驱动下的以潮霉素为筛选标记的表达载体pCAMBIA1301-pRP1-Ycf1p。

本发明还提供了一种用于培育重金属低积累的转基因植物的载体，所述载体含有酵母Ycf1p基因与根表皮细胞膜特异启动子Prp1；

其中，所述酵母Ycf1p基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，根表皮细胞膜特异启动子Prp1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了一种含有前述载体的工程菌。