[发明专利]一种甲鱼系统性败血症病毒检测试纸条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫化学检测技术，尤其是涉及一种基于卵黄抗体、胶体金免疫层析技术的用以快速检测动物各种组织、血液及粪便中甲鱼系统性败血症病毒的检测试纸及其制备方法。

背景技术

甲鱼是最负盛名的滋补强体珍品之一，全身皆可入药，是我国传统的中药材，具有较高的经济价值。随着人民生活水平日益提高以及对甲鱼的食用、药用价值认识的深入，甲鱼的需求量不断增大，人工养殖甲鱼业应用而生。但随着养殖规模的扩大，疾病频频暴发，愈演愈烈，其中主要以甲鱼系统性败血症为主。

甲鱼系统性败血症是发生于甲鱼生态养殖场的一种暴发性疾病，6—9月份为其发病高峰期，其来势凶猛，7-10天内发病池塘累积死亡率可达90-100％。病鳖主要为体重150-200g的幼鳖，成鳖也有患病感染。该病的原发性病原为甲鱼系统性败血症球状病毒(Soft-shelled turtle systemic septicemia spherical virus，STSSSV)(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5378)，患病甲鱼主要症状为出血性败血，心、肝、肠胃等组织中存在大量球状病毒颗粒。经调查，甲鱼系统性败血症一旦爆发，常规药物治疗无效，给养殖产业带来巨大经济损失。因此，在苗种购买、引进和发病初期进行检测，确定病情，以便及时采取措施控制传染和情况恶化，对减少养殖场损失具有重要意义。

目前，病原体的检测方法主要有分离培养、电镜观察、PCR、ELISA、色谱分析等，这些方法多耗时耗力，需要专用场地和仪器设备，需要专业人员操作。研究人员已成功建立了ELISA 检测甲鱼系统性败血症病毒（STSSSV）的技术，但是整个检测过程至少需要数小时，且对操作者要求较高，需要酶标仪这样的专业设备。

胶体金免疫层析（gold-immunochromatography assay GICA）是20世纪80年代开始发展起来的新的免疫分析方式，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，基于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。依据胶体金免疫层析技术，在国内外无论人医应用方面，还是兽医应用方便，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测各种病原和有毒有害物质的试纸条。但是，目前国内外还没有公开任何关于甲鱼系统性败血症病毒检测试纸条及其制备方法的相关研究报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种基于胶体金免疫层析技术的特异性强、灵敏度高、检测速度快、成本低并且操作简便的甲鱼系统性败血症病毒检测试纸条及其制备方法，满足了现场快速检测的需求。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种甲鱼系统性败血症病毒检测试纸条，所述的试纸条由条形底板和在条形底板上依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述的结合垫上包被有抗甲鱼系统性败血症病毒卵黄抗体—胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上分别设置有由甲鱼系统性败血症病毒抗原包被的检测线和由兔抗鸡卵黄抗体（IgY）包被的质控线。

所述的抗甲鱼系统性败血症病毒卵黄抗体—胶体金标记物的制备方法如下：将抗甲鱼系统性败血症病毒卵黄抗体与胶体金颗粒直径为15-30nm的胶体金溶液按6-8μg：1mL混合，在pH5.4的条件下通过搅拌振荡30-60min使其结合，加含10wt%的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min去除未充分稳定的胶体金颗粒及其凝聚物，再高速离心12000-15000rpm，1-1.5h去除未结合的抗甲鱼系统性败血症病毒卵黄抗体，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体—胶体金标记物。

一种甲鱼系统性败血症病毒检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

（1）样品垫的制备

 将玻璃纤维纸浸泡于含1wt%牛血清白蛋白、2.5wt%蔗糖、1wt%海藻糖、1wt%吐温-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液中30min后取出，于37℃干燥2-3h即得到样品垫，真空封装，4℃保存备用；

（2）特定包被的结合垫的制备

 将玻璃纤维纸浸泡于含1wt%牛血清白蛋白、2.5wt%蔗糖、1wt%海藻糖，1wt%吐温-20的0.01M pH7.4的PBS缓冲液中30min后，于37℃干燥1-2h后，在每平方厘米的玻璃纤维纸上均匀喷涂10-20μL的抗甲鱼系统性败血症球状病毒卵黄抗体—胶体金标记物，真空冷冻干燥1-2h，即得到结合垫，真空封装，4℃保存备用；