[发明专利]一株顺式环氧琥珀酸水解酶产生菌及其在L-酒石酸生产中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株双头菌属CICC 23800菌株（Labrys sp. CICC 23800），其可以用于生物转化顺式环氧琥珀酸钠生产L-酒石酸。 

背景技术

L (+ ) 酒石酸， 即2， 3-二羟基丁二酸，为天然有机酸，无水结晶、无臭、味酸、无色透明，属单斜晶系，相对密度 1.76，熔点 168℃~170℃，易溶于水、甲醇、乙醇，难溶于乙醚、氯仿。 

L(+)-酒石酸是一种天然有机酸，广泛分布于自然界，特别是葡萄和罗望子果中。L(+)-酒石酸首先由 Scheele 于 1769 年从葡萄酒中发现，是一种重要的食品添加剂和工业原料。作为食品添加剂，它的酸味值约是柠檬酸的 1.25倍，可作为饮料、糖果及葡萄酒等的酸味剂，它和柠檬酸、氧化亚铁产生鲜绿色可作为食用色素用于糕点，亦可用作防腐剂和乳化稳定剂。在工业方面主要用于印染的防染剂、照相显影剂、金属离子隐匿剂；在制药工业中，可作为药物拆分剂，如在生产抗结核药乙胺丁醇中，L(+)-酒石酸作为不可替代的拆分剂用于拆分中间体(±)-2-氨基丁醇，它也可作为酒石酸苯茚胺，酒石酸异丁嗪等药品的成盐剂；此外在电镀和制革等行业也有广泛的用途。 

L-酒石酸生产方法主要有酒石提取法、化学合成法、直接发酵法以及生物转化法。但最具有工业生产价值的方法是生物转化法。 

（1）    酒石提取法：早期酒石酸主要从葡萄酒酿造的副产物酒石中提取，缺点是酒石供应量有限、来源不稳定。 

（2）    化学合成法：化学法合成酒石酸为D-酒石酸和L-酒石酸的混合体，还需进行光学异构体拆分才能得L-酒石酸，生产成本较高。 

（3）    直接发酵法：1929年佳木首先报道了灰绿曲霉（Aspergillus glaucus）在葡萄糖基质上产生L(+)-酒石酸；1968年山田浩一等人采用Gluconobacter Suboxyans IAM-1829(ATCC 621)直接发酵生产L(+)-酒石酸，产酸为14.6g/L，转化率为29.2%。直接发酵法生产L-酒石酸产酸及转化率低，目前处于研究阶段。 

（4）    生物转化法：利用微生物产生的顺式环氧琥珀酸水解酶(ESH) 水解顺式环氧琥珀酸钠成L (+)-酒石酸生物转化的方法。目前报道的，产顺式环氧琥珀酸水解酶微生物菌种主要有：无色杆菌(Achromobacter tartarogens)和产碱杆菌(Alcaligenes epoxylyticus)，诺卡氏菌(Nocardia tartaricans)，棒状杆菌(Corynebacterium sp.)，强壮根瘤菌(Rhizobium validum)等。生物转化法的主要优点是反应立体专一性强，转化率高，基本上没有其他副产物，后期的分离提纯也更加方便。 

发明内容

本发明所解决的技术问题为通过自主选育获得一株产顺式环氧琥珀酸水解酶的微生物菌种双头菌属CICC 23800（Labrys sp. CICC 23800），用于水解顺式环氧琥珀酸钠生产L-酒石酸，转化效率高，降低了L-酒石酸生产成本。 

本发明自主选育的双头菌属CICC 23800（Labrys sp. CICC 23800）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.9849。 

本发明的双头菌属CICC 23800（Labrys sp. CICC 23800）顺式环氧琥珀酸水解酶活力高，经过发酵培养酶活力可达2300U/g湿细胞。用于水解顺式环氧琥珀酸钠生产L-酒石酸，底物顺式环氧琥珀酸钠浓度高，因而可生物合成高浓度的L-酒石酸，便于后续提取，可提高生产效率，降低生产成本。 

本发明进一步提供一种微生物转化顺式环氧琥珀酸钠生产L-酒石酸的方法。将双头菌属CICC 23800发酵培养后发酵液离心获得微生物菌体，加入顺式环氧琥珀酸钠溶液，通过菌体细胞内的顺式环氧琥珀酸水解酶，光学专一性水解顺式环氧琥珀酸钠，生成L-酒石酸，然后经过氯化钙沉淀、过滤水洗得酒石酸钙沉淀，再经硫酸溶液酸解，过滤水洗得L-酒石酸溶液，经浓缩、热滤、结晶得L-酒石酸成品。 

具体步骤为： 

（1）  将双头菌属CICC 23800斜面菌种，接种种子培养基，25~37℃发酵培养18~30h得接种液；