[发明专利]一种透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法

权利要求书

1.一种透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，步骤是： 

(1)使用0.05～0.5M、pH值为5.5～9.0的Tris-HCl缓冲液分别配制浓度为0.1M的UDP-GlcNAc(尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖)溶液，浓度为0.1M的UDP-GlcA(尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸)溶液，备用； 

(2)使用去离子水配制浓度为0.1M的末端带有葡萄糖醛酸的黄酮化合物，备用； 

(3)使用0.05～0.5M、pH值为6.5～8.5的Tris-HCl缓冲液配制浓度为30mg/mL的透明质酸合酶溶液，备用； 

(4)将步骤(1)制得的UDP-GlcNAc溶液与步骤(2)制得的末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物溶液按1～3:0.5～1的体积比混合，28℃水浴中孵育10±2分钟，再加入反应溶液总体积10～30％的浓度为30mg/mL的透明质酸合酶溶液，28～32℃水浴中反应20～28小时，100℃煮沸，得反应液； 

(5)将步骤(4)制得的反应液在2～8℃条件下8,000～13,000转/分钟离心20～60分钟，收集上清液； 

(6)将步骤(5)收集的上清液在30～37℃的条件下旋转蒸发30～60分钟去除多余水分，得浓缩反应液； 

(7)将步骤(6)制得的浓缩反应液使用分子筛凝胶层析纯化，以去离子水为流动相，按柱体积0.2～1.5％的体积比例进行上样，层析柱选择内径为1.0～3.5厘米，长度为1.0米的普通中压层析柱，洗脱流速为70～90mL/小时，收集洗脱液，然后利用薄层层析进行产物鉴定，对含有目标产物的收集组分进行合并，冷冻干燥，即得透明质酸二糖修饰的黄酮化合物； 

(8)将步骤(7)制得的透明质酸二糖修饰的黄酮化合物用浓度为0.05～0.5M、pH值为5.5～8.0的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为0.1M的透明质酸二糖修饰的黄酮化合物溶液； 

(9)将步骤(1)制得的UDP-GlcA溶液与步骤(8)制得的透明质酸二糖修饰的黄酮化合物溶液按1～3:0.5～1的体积比混合，28℃水浴中孵育10±2分钟，再加入反应溶液总体积10～30％的浓度为30mg/mL的透明质酸合酶溶液，28～32℃水浴中反应16～24小时，100℃煮沸，得反应液； 

(10)将步骤(9)制得的反应液在2～8℃条件下8,000～13,000转/分钟离心20～60分钟，收集上清液； 

(11)将步骤(10)收集的上清液在30～37℃的条件下旋转蒸发30～60分钟去除多余水分，得浓缩反应液； 

(12)将步骤(11)制得的浓缩反应液使用分子筛凝胶层析纯化，以去离子水为流动相，按柱体积0.2～1.5％的体积比例进行上样，层析柱选择内径为1.0～3.5厘米，长度为1.0米的普通中压层析柱，洗脱流速在70～90mL/小时，收集洗脱液，利用薄层层析进行产物鉴定，对含有目标产物的收集组分进行合并，冷冻干燥，即得透明质酸三糖修饰的黄酮化合物； 

(13)将步骤(12)制得透明质酸三糖修饰的黄酮化合物用浓度为0.05～0.5M、pH值为5.5～8.0的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为0.1M的透明质酸三糖修饰的黄酮化合物溶液； 

(14)将步骤(1)制得的UDP-GlcA溶液与UDP-GlcNAc溶液以及步骤(13)制得的透明质酸三糖修饰的黄酮化合物按反应溶液终摩尔浓度比为1～1000:1～1000:1的比例混合，28℃水浴中孵育10±2分钟，再加入反应溶液总体积10～30％的浓度为30mg/mL的透明质酸合酶溶液，28～32℃水浴中反应10～16小时，100℃煮沸，得反应液； 

(15)将步骤(14)制得的反应液在2～8℃条件下8,000～13,000转/分钟离心20～60分钟，收集上清液； 

(16)将步骤(15)收集的上清液在30～37℃的条件下旋转蒸发30～60分钟去除多余水分，得浓缩反应液； 

(17)将步骤(16)制得的浓缩反应液透析去除小分子杂质，选择截留分子量范围为100～1,000的超滤管，6,000转/分钟离心30±5分钟，收集超滤后的组分，进行冷冻干燥，即获得透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物。 

2.如权利要求1所述透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，其特征在于：步骤(1)、(3)、(8)或(13)中所述的Tris-HCl缓冲液浓度为0.05M，其pH值为7.5。