[发明专利]一种透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域。涉及一种透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法。 

背景技术

黄酮类化合物(Flavonoid)是广泛存在于自然界的一类重要的多酚类化合物，以2-苯基色原酮(2-phenylchromone)为母核，两个苯环(A与B环)通过中央三碳链相互联结而形成的一系列化合物。黄酮类化合物在植物界分布很广，是植物次级代谢的产物，多存在于高等植物及羊齿类植物中。直接从天然植物中提取的黄酮类化合物一般以游离态或糖苷形式存在，分子中含有多个酚羟基。 

黄酮类化合物的抗癌活性研究已经成为肿瘤预防和治疗研究的一个热点，是具应用前景的新型抗癌药物或抗癌辅助药物，目前存在的弊端是黄酮类化合物的生物利用度不甚理想。故提高黄酮类化合物的水溶性、增强其化合物的药物活性，是黄酮类抗癌药物亟待研发的热点之一。 

目前的肿瘤学研究发现，透明质酸(hyaluronan，HA)在肿瘤发生发展过程中起到重要的作用。透明质酸是由重复二糖单位连接而成的长链酸性粘多糖，二糖单位中有一分子乙酰氨基葡萄糖和一分子葡萄糖醛酸。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能。透明质酸与肿瘤的关系也很密切，肿瘤细胞表面会过表达能够与透明质酸特异结合的受体，透明质酸与其结合以后会激活细胞内多条信号通路，从而引起巨噬细胞的聚集、细胞迁移、软骨细胞基质的形成等。近期研究表明，透明质酸与肿瘤细胞表面受体CD44结合以后，会通过胞吞作用进入到细胞内，这意味 着透明质酸能够作为一种肿瘤药物定向传输标签，可以将抗癌药物定向转运到肿瘤细胞内，实现抗癌药物的靶向杀伤。 

然而，经检索，以末端带有葡萄糖醛酸的黄酮类化合物为先导，在透明质酸合酶的催化作用下，在黄酮化合物的末端葡萄糖醛酸基团上进行透明质酸寡糖链的延伸，制备获得透明质酸寡糖链修饰的黄酮类化合物的专利或文献还未见报道。 

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法。 

本发明所述透明质酸寡糖链修饰末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物的方法，步骤是： 

(1)使用0.05～0.5M、pH值为5.5～9.0的Tris-HCl缓冲液分别配制浓度为0.1M的UDP-GlcNAc(尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖)溶液，浓度为0.1M的UDP-GlcA(尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸)溶液，备用； 

(2)使用去离子水配制浓度为0.1M的末端带有葡萄糖醛酸的黄酮化合物，备用； 

(3)使用0.05～0.5M、pH值为6.5～8.5的Tris-HCl缓冲液配制浓度为30mg/mL的透明质酸合酶溶液，备用； 

(4)将步骤(1)制得的UDP-GlcNAc溶液与步骤(2)制得的末端带葡萄糖醛酸的黄酮化合物溶液按1～3:0.5～1的体积比混合，28℃水浴中孵育10±2分钟，再加入反应溶液总体积10～30％的浓度为30mg/mL的透明质酸合酶溶液，28～32℃水浴中反应20～28小时，100℃煮沸，得反应液； 

(5)将步骤(4)制得的反应液在2～8℃条件下8,000～13,000转/分钟离心20～60分钟，收集上清液； 

(6)将步骤(5)收集的上清液在30～37℃的条件下旋转蒸发30～60分钟去除多余水分，得浓缩反应液； 

(7)将步骤(6)制得的浓缩反应液使用分子筛凝胶层析纯化，以去离子水为流动相，按柱体积0.2～1.5％的体积比例进行上样，层析柱选择内径为1.0～3.5厘米，长度为1.0米的普通中压层析柱，洗脱流速为70～90mL/小时，收集洗脱液，然后利用薄层层析进行产物鉴定，对含有目标产物的收集组分进行合并，冷冻干燥，即得透明质酸二糖修饰的黄酮化合物； 

(8)将步骤(7)制得的透明质酸二糖修饰的黄酮化合物用浓度为0.05～0.5M、pH值为5.5～8.0的Tris-HCl缓冲液配制成浓度为0.1M的透明质酸二糖修饰的黄酮化合物溶液； 

(9)将步骤(1)制得的UDP-GlcA溶液与步骤(8)制得的透明质酸二糖修饰的黄酮化合物溶液按1～3:0.5～1的体积比混合，28℃水浴中孵育10±2分钟，再加入反应溶液总体积10～30％的浓度为30mg/mL的透明质酸合酶溶液，28～32℃水浴中反应16～24小时，100℃煮沸，得反应液；