[发明专利]表面离子共振技术检测新城疫病毒的非诊断性方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种表面离子共振技术检测新城疫病毒的非诊断性方法，属于生物技术检测领域。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种严重威胁我国的规模化养禽场的烈性传染病，一般可分为强毒力型、中毒力型及弱毒力型，是动物产品国际贸易中重点检查的对象。目前用于监控NDV的常用方法免疫学方法如血凝与血凝抑制试验，ELISA，免疫组化和免疫荧光等。但均不能实时监测生物大分子之间的相互作用，动态观察大分子之间结合与解离的平衡关系,较为准确地测定分子间相互作用的亲和力。目前已成为筛选各类抗体建立免疫学反应的瓶颈和关键。同时传统的免疫血清学诊断方法大多需要标记各类抗体，无法在大规模推广应用前实现对抗体或参考抗原的筛选工作，因而需要研究一种相对廉价，并能够对新城疫病毒的血清学诊断方法在建立推广之前进行高通量快速筛选、准确鉴别的集成化诊断技术。

表面等离子体共振技术(SPR)是利用在金属膜/液面界面，由光的全反射引起的物理光学现象来分析分子间相互作用的技术。SPR仪由自动采样机械手、高分辨率的CCD照相仪和上面布有一个或多个流池的镀金或镀银SPR生物传感器芯片构成。SPR技术在检测、分析生物分子间的相互作用等方面得到广泛的应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种利用表面等离子体共振技术来检测新城疫病毒的方法，同时，所述的方法也可快速筛选一株适配的新城疫单克隆抗体。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：表面离子共振技术检测新城疫病毒的非诊断性方法，包括下列步骤：

(1)鼠抗抗体的偶联：鼠抗抗体与表面离子共振系统中的生物传感器芯片偶联；

(2)新城疫单克隆抗体的捕获及捕获浓度的确定；

(3)样品的检测：将待测样品流过表面离子共振系统中的生物传感器芯片的流池，测定混合物流过芯片之前和之后相应流池的信号差值，根据上述信号差值确定所述病毒是否存在及其含量。

具体的，上述步骤具体为：

鼠抗抗体与表面离子共振系统中的生物传感器芯片偶联的具体步骤为：在室温20-25摄氏度条件下，将试剂放在样品架上，设定加样流速为10μL/min，以inject方式进样，顺次用110μLNHS/EDC混合液活化芯片表面，再加入过量的鼠抗抗体偶联在活化后的芯片表面上，偶联完毕后用60μL Ethanolamine HCl封闭，使过量的反应基团失活；分析偶联效果时，通过在开始注射鼠抗抗体前放置一个基线报道点，并在注射Ethanolamine HCl结束后放置第二个报道点，如信号差在1000-5000RU之间，则结合鼠抗的水平良好。通常芯片偶联抗体后可进行100次左右的结合及再生实验。

新城疫单克隆抗体与鼠抗抗体结合的具体步骤为：准备0.1～0.5μg/ml的含新城疫单克隆抗体的腹水样品和100～1000nM的新城疫重组蛋白抗原，经0.22μm的微孔过滤备用。在配体通道上进样10μL单抗腹水样品。然后同时在空白参比通道和配体通道上进样3min抗原，解离5min，设定流速为10μL/min。为最大限度降低背景值，应控制捕获单抗后抗原检测的RU信号差值处在30～50RU的合理区间，以此确定为合适的单抗捕获浓度，后续的样品检测均以此捕获浓度的单抗进样。最后用pH3.0的缓冲液10mM Glycine HCl进行再生。

检测样品的具体步骤为：待检抗原经0.22μm的微孔过滤备用。设定流速为10μL/min，在相应的的配体通道上进样10μL确定好浓度的新城疫单抗。分别注射25μL的HBS缓冲液(作为阴性对照)和待检抗原，顺次进样与单抗结合，并限定120s解离时间，最后用pH3.0的缓冲液10mM Glycine HCl进行再生。通过在开始注射单抗后放置一个基线报道点，并在注射待检样品后放置第二个报道点。阴性对照无任何差值，阳性样品信号有差值，以此确定有新城疫病毒的存在。

本发明的有益效果是：能够很快捷地发现鼠抗抗体与单抗分子间能否发生结合。通过直接捕获杂交瘤上清、腹水抗体，在5～10分钟内即可快速筛选一株适配的单克隆抗体，运行成本更低，芯片亦可反复使用，这为大面积推广所筛选的抗体在其他免疫学实验中的应用提供了重要的参考数据。

本发明的检测方法在检测其他禽源病毒时无阳性响应信号，特异性强；对新城疫病毒重组蛋白的检测极限达0.3125nmol/L，灵敏度高。

具体实施方式

图1是本发明的特异性实验结果。