[发明专利]一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法

权利要求书

1.一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，步骤是：

(1)使用浓度为0.05M～0.5M、pH值为5.5～8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为0.1M的N-乙酰氨基葡萄糖溶液和浓度为0.1M葡萄糖醛酸溶液，备用；

(2)使用浓度为0.05M～0.5M、pH值为5.5～8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液和浓度为0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液，备用；

(3)使用浓度为0.05M～0.5M、pH值为6.5～8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度均为50mg/mL的N-乙酰氨基葡萄糖激酶溶液、葡萄糖醛酸激酶溶液、N-乙酰氨基葡萄尿苷转移酶溶液、葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液、透明质酸合酶溶液，备用；

(4)将步骤(1)、(2)中制得的0.1M的N-乙酰氨基葡萄糖溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液与0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按体积比1:1～3:1～2混合，30±1℃水浴中孵育10±2分钟，再加入孵育时混合液体积35～65％的步骤(3)中制得的50mg/mL N-乙酰氨基葡萄糖激酶溶液与50mg/mL N-乙酰氨基葡萄尿苷转移酶溶液按体积比1.1～1.3:1混合的酶液，充分混匀后，在30～37℃水浴中反应12～48小时，得反应液，该反应液命名为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)反应液；

(5)将步骤(1)、(2)中制得的0.1M的葡萄糖醛酸溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液与0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按1:1～3:1～2的体积比混合，30±1℃水浴中孵育10±2分钟，再加入孵育时混合液体积40～60％的步骤(3)中制得的50mg/mL葡萄糖醛酸激酶溶液与50mg/mL葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液按体积比1.1～1.5:1混合的酶液，充分混匀后，在30～37℃水浴中反应12～48小时，得反应液，该反应液命名为尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)反应液；

(6)将尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)反应液与尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)反应液按体积比1:0.8～1.2混合，再加入该混合液体积40～100％的步骤(3)制得的50mg/mL透明质酸合酶溶液，充分混匀后，在28～35℃水浴中反应24～48小时，100℃煮沸5～10分钟，得反应液，该反应液命名为透明质酸反应液；

(7)将步骤(6)制得的透明质酸反应液在2～8℃条件下8,000～13,000转/分钟离心20～60分钟，收集上清液；

(8)将步骤(7)制得的上清液在30～40℃的条件下旋转蒸发30～60分钟，去除多余的水分，得含透明质酸的浓缩液；

(9)选择截留分子量为100～1,000的透析袋，以去离子水作为透析液，对步骤(8)制得的浓缩液实施透析去除小分子杂质，每间隔6-8小时更换一次透析水，透析3～5次，对透析后溶液冷冻干燥，即获得透明质酸产品。

2.如权利要求1所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤(1)、(2)、(3)中所述的磷酸盐缓冲液是浓度为0.05M、pH值为7.5的磷酸钠缓冲液。

3.如权利要求1所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤(4)所述将步骤(1)、(2)中制得的0.1M的N-乙酰氨基葡萄糖溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液与0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按体积比1:1.2:1.2混合，30±1℃水浴中孵育10±2分钟，再加入孵育时混合液体积35～65％的步骤(3)中制得的50mg/mL N-乙酰氨基葡萄糖激酶溶液与50mg/mL N-乙酰氨基葡萄尿苷转移酶溶液按体积比1.2:1混合的酶液，充分混匀后，在37℃水浴中反应16小时，得反应液。

4.如权利要求1所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，其特征在于，步骤(5)所述将步骤(1)、(2)中制得的0.1M的葡萄糖醛酸溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液与0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按1:1.5:1.5的体积比混合，30±1℃水浴中孵育10±2分钟，再加入孵育时混合液体积40～60％的步骤(3)中制得的50mg/mL葡萄糖醛酸激酶溶液与50mg/mL葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液按体积比1.3:1混合的酶液，充分混匀后，在37℃水浴中反应24小时，得反应液。