[发明专利]一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶法合成透明质酸的方法，尤其涉及一种单糖为起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，属于寡糖合成制备技术领域。

背景技术

透明质酸(hyaluronan,hyaluronic acid,HA)，是由重复二糖单位连接而成的长链酸性粘多糖，二糖单位中有一分子N-乙酰氨基葡萄糖和一分子葡萄糖醛酸以[-β3-GlcNAc-β1-4-GlcA-1-]连接方式组成。透明质酸是自然界最简单的一种糖胺聚糖，不与蛋白质共价连接，没有硫酸、异构化修饰，以游离形式存在。透明质酸以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能。此外，透明质酸还会影响细胞移动、增生分化以及细胞吞噬。

透明质酸生产方法目前主要有两种，一是动物组织提取法，如鸡冠、脐带、眼玻璃体、猪皮等，经过提取、除杂、沉淀和分级分离等过程制得。动物组织提取存在透明质酸污染的潜在问题，如动物病毒的残存。二是微生物发酵法生产透明质酸，微生物发酵是目前透明质酸生产的主要方法，但微生物发酵法存在发酵周期长、产物纯化步骤繁琐等问题。药用透明质酸制备过程，还需要考虑内毒素的去除问题，严重制约了透明质酸类产品的开发和应用。

已报道的透明质酸的酶法合成主要由透明质酸合酶催化完成，需要使用价格昂贵的糖核苷酸：尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)和尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)作为底物，严重制约了透明质酸的酶法合成的深入开展。

经检索，有关以单糖为起始，偶联以单糖为底物的糖核苷酸酶法合成和以糖核苷酸为底物的透明质酸酶法合成，多酶偶联合成透明质酸的方法，还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法。

本发明所述单糖起始的多酶偶联合成透明质酸的方法，步骤是：

(1)使用浓度为0.05M～0.5M、pH值为5.5～8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为0.1M的N-乙酰氨基葡萄糖溶液和浓度为0.1M葡萄糖醛酸溶液，备用；

(2)使用浓度为0.05M～0.5M、pH值为5.5～8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度为0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液和浓度为0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液，备用；

(3)使用浓度为0.05M～0.5M、pH值为6.5～8.0的磷酸盐缓冲液分别配制浓度均为50mg/mL的N-乙酰氨基葡萄糖激酶溶液、葡萄糖醛酸激酶溶液、N-乙酰氨基葡萄尿苷转移酶溶液、葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液、透明质酸合酶溶液，备用；

(4)将步骤(1)、(2)中制得的0.1M的N-乙酰氨基葡萄糖溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液与0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按体积比1:1～3:1～2混合，30±1℃水浴中孵育10±2分钟，再加入孵育时混合液体积35～65％的步骤(3)中制得的50mg/mL N-乙酰氨基葡萄糖激酶溶液与50mg/mL N-乙酰氨基葡萄尿苷转移酶溶液按体积比1.1～1.3:1混合的酶液，充分混匀后，在30～37℃水浴中反应12～48小时，得反应液，该反应液命名为尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)反应液；

(5)将步骤(1)、(2)中制得的0.1M的葡萄糖醛酸溶液、0.1M的腺苷三磷酸(ATP)溶液与0.1M的尿苷三磷酸(UTP)溶液按1:1～3:1～2的体积比混合，30±1℃水浴中孵育10±2分钟，再加入孵育时混合液体积40～60％的步骤(3)中制得的50mg/mL葡萄糖醛酸激酶溶液与50mg/mL葡萄糖醛酸尿苷转移酶溶液按体积比1.1～1.5:1混合的酶液，充分混匀后，在30～37℃水浴中反应12～48小时，得反应液，该反应液命名为尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)反应液；

(6)将尿苷二磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)反应液与尿苷二磷酸-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)反应液按体积比1:0.8～1.2混合，再加入该混合液体积40～100％的步骤(3)制得的50mg/mL透明质酸合酶溶液，充分混匀后，在28～35℃水浴中反应24～48小时，100℃煮沸5～10分钟，得反应液，该反应液命名为透明质酸反应液；

(7)将步骤(6)制得的透明质酸反应液在2～8℃条件下8,000～13,000转/分钟离心20～60分钟，收集上清液；

(8)将步骤(7)制得的上清液在30～40℃的条件下旋转蒸发30～60分钟，去除多余的水分，得含透明质酸的浓缩液；