[发明专利]蛋白产品的总核苷酸测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及核苷酸测定技术领域。

背景技术

单细胞蛋白(Single cell protein简称SCP)又称微生物蛋白或菌体蛋白，是利用工业废水、废气、天然气、石油烷烃类、农副加工产品以及有机垃圾等作为培养基，培养酵母、非病源性细菌、微型菌、真菌等单细胞生物体，然后经过净化干燥处理后制成，是食品工业和饲料工业重要的蛋白质来源。

单细胞蛋白与其它蛋白相比的一大优点就是其较少的细胞培养时间，微生物有机体蛋白产品的产率比其它传统蛋白产率要高。单细胞蛋白(SCP)与传统蛋白相比具有不受环境和气候的影响、原料易得、可连续生产、易于控制、污染小等优势。

单细胞蛋白产品含有丰富的蛋白质，氨基酸的种类齐全，比例适当。单细胞蛋白还含有丰富的脂肪、碳水化合物、核酸、维生素和无机盐，并含有钙、磷、钾、铁、镁、钠、锰等矿物质元素，还含有多种酶。

核苷酸是细胞组成主要成分，是组成DNA和RNA单体，在细胞结构、代谢、能量和调节功能等方面起重要作用，其生理生化功能有：作为RNA和DNA合成的原料；作为代谢的调节物质；作为辅酶的成分，如辅酶A；激活糖原和糖蛋白合成的重要中介物，也是磷脂合成的中介物，活化中间产物；参与遗传信息传递；ATP是生命过程的直接能；AMP调节平滑肌的收缩性并可调节血流量；核苷酸还可以作为甲基的供体等。因此外源核苷酸具有重要生物学作用。

饲料工业中单细胞蛋白是外源核苷酸的廉价且非常可靠的来源。因此，确定原料中准确的核苷酸的含量就是一件非常重要的工作。

目前核酸类的测定方法可以分为两大类：核酸的定量分析及核酸水解物的测定。

核酸的定量方法主要有：定磷法、紫外法、苔黑酚法。核酸水解物的测定包含测定核苷酸、核苷及各种碱基，这些水解物比较成熟的方法是使用高效液相色谱仪进行的，有些也已经有成熟的应用，例如，婴幼儿乳粉中游离核苷酸的测定。然而，上述方法都各有特点及缺点，有其特定的适用范围，在应用于测定单细胞蛋白核苷酸的测定时会产生很多问题，从而导致测定结果出现错误。

定磷法测定原理是核酸分子结构中含有一定比例的磷(RNA含磷量约为8.5％^～9.0％)，测定其含磷量即可换算出核酸的量。但是方法无法区分核酸磷和其他有机磷，这会导致蛋白原料中的核酸磷及其他有机磷全部计算为核酸的含磷，从而导致测定结果显著偏高。

吸光度法测定核酸的原理是利用核酸中碱基含有的共轭双键的260nm紫外吸光度的特点进行测定。该方法的缺点是：1)实质上定量的是共轭双键的含量；2)含有共轭双键的物质包括：核酸、寡核苷酸、核苷酸、核苷、碱基、1,3‐丁二烯、环己烯等核酸及非核酸类物质；4)共轭双键的含量大小依次是：碱基>核苷>核苷酸；6)分子生物学上指出了紫外法测定只适用于纯的核酸样品，不适用于含有多种核酸水解物的样品。因此也不适用于酵母、酶解酵母等单细胞蛋白原料，因为它们除了有核酸也含有很多核酸的水解物。

苔黑酚法测定核酸的原理是：核酸在酸水解后，降解形成的核糖转变为糠醛，后者与地衣酚(3,5-二羟甲苯)作用生成绿色化合物，在670nm处有最大吸收。其缺点是：地衣酚反应特异性较差，凡戊糖均有此反应，核酸水解物及糖类物质对其测定结果影响较大。因此对于化学组分复杂多样的单细胞蛋白类的产品测定结果会误差很大。

核酸水解物包括核苷酸、核苷、碱基。核苷酸包括鸟苷酸、腺苷酸、尿苷酸、胞苷酸、肌苷酸。核苷包括鸟苷、腺苷、尿苷、肌苷、胞苷。核糖核酸的碱基有四种腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶，脱氧核糖核酸还具有胸腺嘧啶。这些水解物已有文献报道可使用高效液相色谱测定其含量。

公告授权号为CN102680601B的发明专利<乳粉中核苷酸高效液相色谱测定方法>公开了一种乳粉中测定核苷酸的方法，公开了使用液相色谱的液相条件、标准品、样品前处理方法等，很好的解决了乳粉核苷酸的测定。但是和其他液相测定核苷酸的方法类似，在应用于单细胞蛋白的核苷酸测定时显示了不适用的情况。不适用的原因为：1)方法多为游离态的核苷酸；2)只测定了核苷酸没有测定核苷，对动物营养角度来说，核酸水解物除了碱基以外都能发挥营养及免疫的功能；3)细胞核内的未游离态核苷酸不能测定；4)在实际的单细胞蛋白原料中核苷酸的形态多样，有核苷形式、核苷酸形式、二磷酸核苷酸、三磷酸核苷酸、寡核苷酸，这些都没有在测定方法中有所体现。

发明内容