[发明专利]一种恶臭假单胞菌检测试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，其特征在于：所述的试纸条由PVC底板和在PVC底板上依次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸水垫；所述的结合垫上包被有抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上分别设置有由恶臭假单胞菌超声波破碎液包被的检测线和由兔抗鸡卵黄抗体包被的质控线；所述的恶臭假单胞菌超声波破碎液的包被量为1-2μL/cm；所述的兔抗鸡卵黄抗体的包被量为1-2μL/cm；所述的恶臭假单胞菌超声波破碎液是将恶臭假单胞菌抗原用PBS重悬，经超声波破碎后4000rpm离心5min所得的上清液；所述的试纸条的制备方法包括以下步骤：

(1)样品垫的制备

将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖、1wt％吐温-20的pH 7.2的0.01M PBS缓冲液中30min后取出，于37℃干燥2-3h即得到样品垫，真空封装，4℃保存备用；

(2)特定包被的结合垫的制备

将玻璃纤维纸浸泡于含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，1wt％吐温-20的pH7.2的0.01M PBS缓冲液中30min后，于37℃干燥1-2h后，在每平方厘米的玻璃纤维纸上均匀喷涂10-20μL的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，真空冷冻干燥1-2h，即得到结合垫，真空封装，4℃保存备用；

(3)特定包被的硝酸纤维素膜的制备

将恶臭假单胞菌超声波破碎液用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成检测线，将兔抗鸡卵黄抗体用点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上形成质控线，即得到特定包被的硝酸纤维素膜，真空冷冻干燥1-1.5h，真空封装，4℃保存备用；其中检测线与质控线相互平行，所述的检测线靠近结合垫端，所述的质控线靠近吸水垫端；

(4)试纸条的制备

将步骤(1)得到的样品垫、步骤(2)得到的特定包被的结合垫、步骤(3)得到的特定包被的硝酸纤维素膜和吸水垫按序搭接并粘贴于底板上，裁成4-6mm宽的细条，即得恶臭假单胞菌检测试纸条，真空封装，4℃保存；

所述的结合垫上包被的抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物的制备方法具体操作如下：

将抗恶臭假单胞菌卵黄抗体与胶体金颗粒直径为25-50nm的胶体金溶液按6-8μg：1mL混合后，在pH 5.4的条件下通过搅拌振荡30-60min，加含10wt％的牛血清白蛋白的PBST缓冲液作为稳定剂，采用低速离心2000-3500rpm，10-20min，再高速离心12000-15000rpm，1-1.5h，取离心管底部暗红色沉淀即得到抗恶臭假单胞菌卵黄抗体-胶体金标记物，用含1wt％牛血清白蛋白、2.5wt％蔗糖、1wt％海藻糖，0.02wt％叠氮化钠的pH 7.2的0.01M PBS缓冲液重悬至所述胶体金溶液体积的1/10-1/20作为其工作浓度。

2.根据权利要求1所述的一种恶臭假单胞菌检测试纸条的制备方法，其特征在于所述的恶臭假单胞菌抗原的制备方法如下：取实验室-80℃保存的恶臭假单胞菌种，在LB固体培养基中划线活化，28℃倒置培养24h后挑取单菌落接种于含5mL LB液体培养基的试管中，28℃，200rpm培养12-18h，将培养的菌液用LB液体培养基按1∶100稀释到三角烧瓶中，28℃，200rpm扩大培养，每隔一段时间测其OD600值，当其OD600值达到0.4-0.6时停止培养，将培养的菌液在4℃进行5000rpm离心10min，弃上清，下层沉淀用pH 7.2的0.01M PBS重悬洗涤，再次5000rpm离心10min，沉淀再次用PBS重复上述洗涤2次，最终得到的沉淀即为恶臭假单胞菌抗原。