[发明专利]一种棘白菌素B微生物酶转化方法

说明书

本发明公开了一种棘白菌素B微生物酶转化方法，具体涉及棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的方法。包括在微生物发酵生成棘白菌素B脱酰酶后提取粗酶，然后通过分批添加粗酶及棘白菌素B的方式进行转化。本发明方法的摩尔转化率高，产物浓度高，利于分离纯化，且棘白菌素B底物利于回收再利用，降低了生产成本。

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地，本发明涉及一种棘白菌素B微生物酶转化方法。

背景技术

棘白菌素类(Echinocandins)是20世纪70年代末期发现的一组天然产物，具有类似的环状多肽核心和不同的脂肪酸侧链的结构特征，能够非竞争性抑制真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶活性，临床上作为抗真菌药物使用。

棘白菌素B ( Echinocandin B，简称ECB)由构巢曲霉(Aspergilus nidulans)代谢产生，是棘白菌素类中的一种，其结构如下：

棘白菌素B经脱酰酶作用得到环肽母核(Echinocandin B Nucleus，ECBN)，环肽母核再经过化学修饰可制备得到抗真菌药物阿尼芬净(Anidulafungin )。目前对于ECB母核的制备，化学合成方法成本较高，主要采用微生物转化。微生物转化具有以下优点：反应条件温和，产物单一，高度的化学选择性、区域选择性和对映体选择性，易于纯化，环境污染小，且能完成一些化学合成难以进行的反应。

棘白菌素B母核（ECBN）具有如下结构：

US7785826B2详细介绍了ECB转化ECBN的工艺。此工艺主要流程包括：

将ECB发酵完成以后，离心获得菌丝体，把菌丝体重新悬浮于水中然后加入脱酰酶进行转化。但此方法的摩尔转化率较低，转化时间长，转化需耗时20~30h，生产成本较高。

CN103374593A公开了一种在发酵过程中添加棘白菌素B（ECB）底物转化为棘白菌素B母核的方法；CN102618606B公开了一种棘白菌素类化合物的生物转化方法，包括，将棘白菌素类化合物、缓冲溶液以及助溶剂混合后，再加入全细胞脱酰基酶进行转化；当前文献报道的这些转化方法，主要是犹他游动放线菌(Actinoplanesutahensis) 或其它基因工程菌发酵产生脱酰酶，然后将底物加入到发酵液中进行转化。这一转化体系的缺点在于，存在大量微生物，稳定性差，受发酵液酶活的限制导致投入的ECB底物浓度偏低，产生的ECB母核浓度偏低，整个体系体积较大，不易于分离纯化，且体系中大量菌体和ECB等不溶物的存在导致未转化的ECB难以回收，生产成本较高。

CN103074403B公开了一种将ECB转化为ECBN的方法，涉及发酵完成后通过加磷酸盐、超声、离心、旋蒸浓缩，得到棘白菌素B脱酰酶酶液，然后加入ECB底物进行转化。该方法不足之处在于粗酶提取过程繁琐，不利于工业化放大生产；使用旋蒸的方式提取粗酶，由于温度偏高，易造成蛋白质变性，脱酰酶的活力有负面影响。

因此需要开发一种粗酶提取方式简单、条件温和，成本较低，酶活受到的负面影响较小，同时转化效率高，易于分离纯化，ECB易于回收重复使用的工艺。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有转化工艺存在的不足，提供一种高效的将棘白菌素B转化为棘白菌素B母核的方法。

为达到上述目的，本发明提供以下技术方案：

将棘白菌素B转化成棘白菌素B母核的方法，包括以下步骤：

1）、发酵能将棘白菌素B脱酰酶表达在胞外的基因工程菌，获得棘白菌素B脱酰酶；

2）、发酵完成后，将发酵液过滤或离心，得到上清液，向上清液中加入上清液体积的40%~80%(w/v)重量的非重金属盐，搅拌2~8小时，过滤或离心，收集沉淀，得到粗酶；