[发明专利]一种二联灭活疫苗制备方法

权利要求书

1.一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取PCV2ZJ/C毒株感染宿主细胞进行病毒扩增，确保病毒效价≥10^7.0TCID₅₀/ml，收获细胞毒液；

2)将步骤1)得到的细胞毒液，利用中空纤维滤柱进行澄清浓缩处理；

3)将步骤2)浓缩处理后的病毒在搅拌状态下按0.1～0.3％(v/v)的比例加入β-丙内酯灭活，得到第一抗原原液；

4)取pET28a-FMDV VP1菌株进行培养扩增，而后向培养体系中加入0.1～1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导时间为4～6h，诱导温度为25～37℃，而后收集菌体，破壁，收集包涵体；

5)利用CAPS裂解液或尿素裂解液以15～25mg/mL的浓度重悬步骤4)得到的包涵体，收集上清液，再用Ni²⁺柱纯化蛋白，复性蛋白，再过滤除菌，即得到第二抗原原液；

6)将步骤3)得到的第一抗原原液与步骤5)得到的第二抗原原液按比例混合，即得到混合抗原原液，上述按比例是确保得到的混合抗原原液中PCV2含量为10^7.0TCID50/头份、FMDV VP1蛋白含量为80μg/头份或PCV2蛋白含量为10^7.5TCID50/头份、FMDV VP1蛋白含量为100μg/头份；

7)将步骤6)得到的混合抗原原液与疫苗佐剂搅拌混匀，即得到一种二联灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤1)的具体流程如下：取PCV2ZJ/C毒株按感染复数为0.005～0.02接种于PK-15细胞，34～39℃吸附25～35min，加入含2～5％犊牛血清和0.5～2mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，34～39℃培养，而后反复冻融，确保病毒效价≥10^7.0TCID₅₀/ml，收获病毒。

3.根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤7)混合抗原原液与疫苗佐剂的混合比例为1:1(v/v)。

4.根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤2)滤柱澄清处理之前先利用菲托滤板进行一步过滤处理。

5.根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3)灭活条件为：加入β-丙内酯后置于4℃条件下搅拌灭活48～72h，然后置于37℃水浴2h。

6.根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤4)所述的扩增培养具体包括以下流程：取pET28a-FMDV VP1菌株划线至Kan+抗性培养板，37℃过夜培养，挑取单个菌落接入10mL含有Kan+的液体LB培养基中，37℃220r/min振荡培养11-16h。

7.根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤4)所述的破壁具体包括以下流程：用1/10菌液体积的PBS缓冲液重悬菌体，加100μg/mL溶菌酶，于冰上超声破碎菌体。

8.根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤4)具体包括以下流程：IPTG诱导浓度为0.8mmol/L，诱导时间为5h，诱导温度为，37℃。

9.根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤5)所述的Ni²⁺柱为Ni-NTA柱。

10.根据权利要求1所述的一种二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤5)所述的复性方法为：稀释复性结合超滤浓缩。