[发明专利]一种二联灭活疫苗制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种二联灭活疫苗制备方法。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)感染引起的一种急性和高度接触性的动物传染病。FMDV感染对象为牛、羊、猪等家养以及野生的偶蹄动物。流行病学调查和感染实验证明，约有100多种动物可感染此病毒。该病的临床特征是传播速度块、流行范围广，成年动物的口腔黏膜、蹄部和乳房等处发生水泡和溃烂，幼龄动物多因心肌受损导致较高的死亡率。除动物死亡造成直接经济损失外，动物在患病期间肉和奶的生产停止，哺乳期产奶量降低，耐过动物生长缓慢，种用价值丧失，也可造成严重的经济损失。本病分布于世界各地，在亚洲、非洲、南美洲和中东等地区广泛流行，而已消灭口蹄疫的国家和地区常有重新爆发本病的例证。鉴于口蹄疫对世界经济发展、生态和谐及社会安全等方面危害极大，国际兽医局(OIE)和联合国粮农组织(FAO)将其列为必须通报的疫病之一，我国也将其列为一类动物传染病的第一位。

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒，而PCV2为致病性的病毒，PCV2除导致仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS)外，还能导致母猪的繁殖障碍，PCVD广泛存在于世界各地的猪群中，造成很大的经济损失。

近年来，我国猪群中PCV2和猪O型FMDV流行十分严重，发病率和死亡率也不断提高，给养猪业造成巨大经济损失。当前对这2种病毒性疫病的防控主要采用灭活疫苗，但PCV2灭活疫苗存在病毒难培养的现实，FMDV灭活疫苗存在因灭活不彻底而散毒的危险。研究表明，利用生物反应器培养的PCV2病毒可提高病毒滴度和重组蛋白研制的亚单位疫苗对FMDV感染具有良好的免疫效果，FMDV的结构蛋白Vp1包含FMDV的主要抗原位点，是病毒的主要免疫保护性抗原，能诱导动物机体产生保护性中和抗体，可用于FMDV亚单位疫苗的研制。因此，研制同时预防这两种病毒性疫病的二联疫苗具有重要意义。急需FMDV和PCV2的二联灭活疫苗，以同时预防O型口蹄疫和PCV2引起的PMWS综合症。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种二联灭活疫苗制备方法，该方法采用原核表达系统表达纯化FMDV-Vp1蛋白，结合现有PCV-2全病毒灭活疫苗生物反应器悬浮培养的高滴度病毒，制备出猪O型口蹄疫VP1亚单位、PCV-2二联灭活疫苗。

为了实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种二联灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

1)取PCV2ZJ/C毒株感染宿主细胞进行病毒扩增，确保病毒效价≥10^7.0TCID₅₀/ml，收获细胞毒液；

2)将步骤1)得到的细胞毒液，利用中空纤维滤柱进行澄清浓缩处理；

3)将步骤2)浓缩处理后的病毒在搅拌状态下按0.1～0.3％(v/v)的比例加入β-丙内酯灭活，得到第一抗原原液；

4)取pET28a-FMDV VP1菌株进行培养扩增，而后向培养体系中加入0.1～1mmol/L的IPTG进行诱导，诱导时间为4～6h，诱导温度为25～37℃，而后收集菌体，破壁，收集包涵体；

5)利用CAPS裂解液或尿素裂解液以15～25mg/mL的浓度重悬步骤4)得到的包涵体，收集上清液，再用Ni²⁺柱纯化蛋白，复性蛋白，再过滤除菌，即得到第二抗原原液；

6)将步骤3)得到的第一抗原原液与步骤5)得到的第二抗原原液按比例混合，即得到混合抗原原液，上述按比例是确保得到的混合抗原原液中PCV2含量为10^7.0TCID50/头份、FMDV VP1蛋白含量为80μg/头份或PCV2蛋白含量为10^7.5TCID50/头份、FMDV VP1蛋白含量为100μg/头份；

7)将步骤6)得到的混合抗原原液与疫苗佐剂搅拌混匀，即得到一种二联灭活疫苗。