[发明专利]试剂盒，其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，特别涉及一种大肠杆菌O157:H7检测试剂盒、其制备方法和应 用，属于微生物检测领域。

技术背景

大肠杆菌O157:H7是目前世界上公认的三大最主要的食源性致病菌之一。自1982年美国 科学家发现以来，其危害日益严重。它可以通过污染猪肉、禽肉、牛肉、牛奶、三明治、果 汁、蔬菜和饮水等进行传播，也可以通过人与动物，人与人之间接触传播，进而危害人的生 体健康。大肠杆菌O157:H7的感染剂量极低，最低10个活菌就可能感染致病。感染患者一般 出现腹部绞痛、非出血性腹泻、呕吐、低度发热症状以及溶血性尿毒综合症，甚至导致急性 肾衰竭而死亡。因此，快速、高灵敏的检测大肠杆菌O157:H7具有非常重大的理论和现实意 义。

相比传统的检测大肠杆菌O157:H7的方法(分离鉴定法、PCR方法和生物传感器方法)， 胶体金免疫层析法可以避免传统方法的耗时费力(一般2-7天)，具有便捷、特异敏感、稳定 性强、快速(一般15分钟)、不需特殊设备、结果判断直观、可以现场进行检测等特点。但 胶体金试纸条的检测灵敏度相对不高(通常高于10⁴CFU/mL)，这个缺陷限制了其在食品和农 产品中的普及使用以及定量检测。虽然业界提尝试通过改良试纸条读取仪和最大限度消除试 纸条背景干扰信号等方式来提高胶体金试纸条的检测灵敏度，但其效果均不明显。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种新型的大肠杆菌O157:H7检测试 剂盒，其通过优化纳米金粒子的光学性能和单分散度，实现光学理论上能与试纸条读取仪光 源波长达到最佳的耦合效果，从而大幅提高试纸条的检测性能。

本发明的另一目的在于提供一种制备所述大肠杆菌O157:H7检测试剂盒的方法。

本发明的再一目的在于提供所述大肠杆菌O157:H7检测试剂盒的用途，例如，利用所述 试剂盒实现的大肠杆菌O157:H7检测方法。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

一种大肠杆菌O157:H7检测试剂盒，包含：

大肠杆菌O157:H7胶体金试纸条，包括：

样本垫，用以向所述试纸条内摄入添加有纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的 液态待检测样品，

以及，表面分布有彼此不重合的检测线和和质控线的检测垫，所述检测线包含仅在有大 肠杆菌O157:H7存在时能与所述纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及大肠杆菌 O157:H7结合的第一抗体，而所述质控线内包含在无大肠杆菌O157:H7存在时就能与所述纳 米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体结合的第二抗体，

所述样本垫与检测垫的边缘部相互接触或重合；

以及，纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，包含单分散的纳米金球和标记在所 述纳米金球上的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，其中所述纳米金球具有与试纸条读取仪光源 波长耦合的等离子光学波长。

在一可选实施方案之中，所述试纸条包括依次分布于基板上的样本垫、检测垫和吸水垫， 其中所述检测垫与吸水垫的边缘部相互接触或重合。

较为优选的，所述单分散的纳米金球的粒子分散度PDI为0.20-0.65，等离子光学波长为 520-560cm^-1，粒径为18-60nm。

尤为优选的，所述单分散的纳米金球的粒子分散度PDI为0.20。

进一步的，所述第一抗体包括大肠杆菌O157:H7兔多抗，所述第二抗体包括驴抗鼠二抗。

进一步的，所述检测垫采用硝酸纤维膜。

前述任一种试剂盒的制备方法，包括：

纳米金球标记大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的制备，包括：将HAuCl₄与柠檬酸三钠在 水相反应体系中于100-150℃恒温回流，使反应溶液颜色从浅黄→浅紫色→浅红色→酒红 色，获得粒子分散度PDI为0.20-0.65的、粒径为18-60nm、等离子光学波长为520-560cm^-1的纳米金球，再将所述纳米金球的分散液与大肠杆菌O157:H7单克隆抗体混合搅拌，并以BSA 和PEG2000进行封闭，离心除去未标记的抗体，用复溶液复溶，备用；