[发明专利]一种以HREAFP为启动子的携带Melittin基因的溶瘤腺病毒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因病毒治疗领域，具体地说，是一种以HREAFP为启动子的携带Melittin基因的溶瘤腺病毒及其应用。

背景技术

原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，位居肿瘤相关死亡的第3位，目前手术切除仍是治疗肝癌的首选方法，但肝癌术后复发率高，5年复发率约60％～70％。其他肝癌的治疗方法还有TACE术、PEI术、射频消融术、放化疗等，然而治疗效果不甚理想，目前肝癌治疗尚无明显效果的药物，因此寻找更好的药物和治疗手段已经成为肝癌治疗面临的重大问题。

基因-病毒治疗是一种结合病毒治疗与基因治疗双重优势的肿瘤治疗新策略。腺病毒是基因治疗常用的载体，具有毒性低、安全性高、宿主范围广及体内外可稳定存在等优点，但是腺病毒感染效率低，靶向性差，限制了其进一步的应用。目前重组的增殖型腺病毒以其独特的优势成为研究的热点，在基因-病毒治疗中的应用越来越广泛，又称溶瘤腺病毒，具有感染、复制、增殖及溶解细胞的特性，它可以利用肿瘤与正常组织细胞间结构及代谢途径的差异，靶向性地在肿瘤细胞内复制增殖，最终裂解肿瘤细胞，同时能长效表达抗肿瘤的外源基因，是一种结合病毒治疗与基因治疗双重优势的肿瘤治疗新策略。因此，怎样提高溶瘤病毒的靶向性，以及寻找抗肿瘤的外源基因是研究的热点。

溶瘤腺病毒的关键在于肿瘤细胞内选择性靶向性的增殖，这些可以通过人工缺失病毒在正常细胞中复制所必需，而在肿瘤细胞中非必须的基因，如P53，或是采用肿瘤或组织特异性启动子来调控病毒复制所需的基因，使得病毒只能在特定类型的肿瘤组织或细胞中复制增殖，如缺氧启动子、端粒酶启动子，肝癌的甲胎蛋白(AFP)启动子、胃肠道肿瘤的癌胚抗原(CEA)启动子等。

蜂毒素是由26个氨基酸残基组成的多肽，其编码基因只有78bp。具有抗菌、消炎、抗辐射、抗关节炎作用及心血管等作用，它在肿瘤治疗领域中的作用已受到极大的重视。我们已经证实蜂毒素高刹量可杀伤肝癌细胞，并且对裸鼠移植瘤有抑制作用。但却具有溶血的副作用，安全剂量范围小，并且其杀伤作用没有选择性。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种以HREAFP为启动子的携带Melittin基因的溶瘤腺病毒。

本发明的再一的目的是，提供一种以HREAFP为启动子的携带Melittin基因的溶瘤腺病毒的制备方法。

本发明的另一的目的是，提供一种以HREAFP为启动子的携带Melittin基因的溶瘤腺病毒的应用。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：一种以HREAFP为启动子的携带Melittin基因的溶瘤腺病毒，所述的溶瘤腺病毒是以HREAFP为启动子，携晚期启动子MLP调控蜂毒素基因的溶瘤腺病毒。

优选的，所述的溶瘤腺病毒是以11型腺病毒为载体，构建以缺氧反应元件HRE启动子和甲胎蛋白启动子AFP杂合启动子共同调控Ela区，Elb区缺失55KDa，携带由晚期启动子MLP调控Melittin基因的溶瘤腺病毒。

优选的，所述的溶瘤腺病毒的制备方法是：将携带Melittin基因的质粒pENTR-MLP-Melittin与腺病毒骨架质粒pPE3-F11B通过LR重组，构建质粒pPE3-F11B-MLP-Melittin，将其与含有杂合启动子HREAFP的质粒PXC20-△Elb-55kda-HREAFP共同转染人胚肾293细胞，得到由HREAFP调控Ela区，Elb区缺失55kda蛋白的携Melittin基因的重组增殖型腺病毒。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：所述的制备方法是：将携带Melittin基因的质粒pENTR-MLP-Melittin与腺病毒骨架质粒pPE3-F11B通过LR重组，构建质粒pPE3-F11B-MLP-Melittin，将其与含有杂合启动子HREAFP的质粒PXC20-△Elb-55kda-HREAFP共同转染人胚肾293细胞，得到由HREAFP调控Ela区，Elb区缺失55kda蛋白的携Melittin基因的重组增殖型腺病毒。

为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：所述的溶瘤腺病毒在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

优选的，所述的肿瘤为肝癌。

优选的，所述的肝癌为甲胎蛋白阳性的肝癌。

本发明优点在于：