[发明专利]一种利用重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法

说明书

技术领域

一种利用重组大肠杆菌生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法，属于微生物基因工程领域。

背景技术

谷氨酰胺(Gln)作为特别的免疫营养素成为各领域的研究热点，尤其在机体应激状态下对维护免疫功能的完整性和维护肠道结构是无法替代的。因此，认为谷氨酰胺是应激状态下的“条件必需氨基酸”。但谷氨酰胺水溶性差(36g/L)，在水溶液、热消毒及长期储存时化学稳定性不足，在加热灭菌的条件下会生成有毒的焦谷氨酸和氨，而含有L-谷氨酰胺的小肽，具有高热稳定性和水溶性，弥补了L-谷氨酰胺的不足，扩大了其在临床上作为静脉营养制剂的应用范围，而L-丙氨酰-L-谷氨酰胺在稳定性和水溶性上均优于其他含L-谷氨酰胺的小肽。

目前，生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的方法有化学合成法、微生物发酵法以及生物转化法。由于化学合成法在合成过程中需要引入和去除保护基团，合成步骤过多，成本过高，并且需要用到有毒试剂，不适合工业生产；微生物发酵法成本低廉，环境温和，但是产量较低，离大规模生产还有一定距离；随着DNA重组技术的发展以及微生物资源的发现，使得微生物转化法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成为工业上很有前景的生产方法。其中微生物转化法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的报道相对较少，其中Yoshinori Hirao等人报导的通过培养表达氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠杆菌酶法生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，在50L发酵罐中，以2.0mL/h的速度流加葡萄糖，发酵培养24h，取一定量的发酵液加入到含500mM底物的1L发酵罐中反应40min，终产量达到67.9g/L。

发明内容

针对目前生物转化法获得L-丙氨酰-L-谷氨酰胺成本高，产量较低的缺陷，本发明要解决的问题是提供一种使含有重组DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性增强的方法。

本发明为了高效利用氨基酸酯酰基转移酶生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，提供了一种使宿主菌中的氨基酸酯酰基转移酶合成基因的拷贝数增加的方法，利用该方法可高效生产L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。

本发明是一种使含有重组DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性增强的方法。其特征是：含有重组DNA的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统是指在一定pH值的水溶液中，作用于游离的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯盐酸盐，生成L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的具有氨基酸酯酰基转移酶的蛋白质的基因片段重组到载体里并转入进宿主菌，得到带有重组DNA并且使L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性增强的宿主菌，经过以下阶段(1)培养大量表达氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠杆菌细胞；(2)过量表达阶段(1)中的氨基酸酯酰基转移酶；(3)将阶段(2)所得作为粗酶源，加入到含有L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯盐酸盐底物氨基酸的一定pH值的水溶液中反应，实现L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的高效生产。

上述的氨基酸酯酰基转移酶是在一定pH条件下，可使游离的L-谷氨酰胺和L-丙氨酸甲酯盐酸盐转化为L-丙氨酰-L-谷氨酰胺的酶。

上述的宿主菌除了大肠杆菌属、棒状杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属等属的微生物菌珠外，还可以使用酵母菌或者动物细胞宿主等。

上述的宿主菌以大肠杆菌等作为宿主菌时，氨基酸酯酰基转移酶表达载体在微生物中独立复制的同时，最好由启动子、核糖体结合序列、氨基酸酯酰基转移酶基因、转录终止序列组成。

上述的宿主菌以大肠杆菌为宿主菌时，表达载体有pET21a、pUC19、pET28a等质粒。

上述的表达载体中启动子可采用lac启动子、PL、trp启动子、trp串联启动子或者T7启动子等。

上述的表达载体中核糖体结合序列，只要在大肠杆菌等宿主中能表达即可，核糖体结合位点和起始密码子之前保留适当的距离

上述的宿主菌以大肠杆菌为宿主时，可使用大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌W3310、大肠杆菌SCS110等。

上述的的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性增强的方法是通过使宿主菌中的氨基酸酯酰基转移酶基因的拷贝数增加来实现。

上述的L-丙氨酰-L-谷氨酰胺生物合成系统活性增强的方法中宿主菌中的氨基酸酯酰基转移酶基因的拷贝数增加是通过导入经密码子优化后的氨基酸酯酰基转移酶基因来实现的。