[发明专利]一种利用重组大肠杆菌发酵生产顺式-3-L-羟脯氨酸的方法

说明书

技术领域

一种利用重组大肠杆菌发酵生产顺式-3-L-羟脯氨酸的方法，属于微生物基因工程领域。

背景技术

顺式-3-L-羟脯氨酸(C3HP)作为一种稀有的环状β-羟基-α氨基酸，不仅是骨胶原的组成成分，而且还是许多次级代谢物，如放线菌素、宜他霉素、远霉素等的组成成分。因此，C3HP成为合成这些抗生素必不可少的基本单元。在医药方面，C3HP不仅可以直接作为肿瘤和胶原蛋白疾病的药物，而且是合成许多药物的重要手性合成子。同时它还能用于合成选择性雄性受体调节剂BMS-564929、碳氢霉烯类抗生素、血管紧张肽转化酶抑制剂、解痉挛制剂等。此外它还能用于合成DNA促旋酶抑制剂，如：cyclothialidine、plusbacin和tripropeptins。在化学合成领域，C3HP作为重要的手性分子用于合成倒千里光裂碱、流涎胺等。在不对称合成领域，它还被直接用做有机金属催化剂。而其他的C3HP衍生物，如卡泊芬净和Pneumocandin B0，能做为抗真菌药物使用。

目前，生产C3HP的方法主要是化学合成法。但是化学合成法存在：(1)生产成本高；(2)合成步骤较多；(3)分离精制工序复杂；(4)生产效率低等缺点。所以，有必要寻求一种新型合成方法进行化学替代，以便实现C3HP大规模工业制造。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种用微生物酶法生产C3HP的方法。

与本发明有关的顺式-3-脯氨酸羟化酶结构基因(P3H)编码顺式-3-脯氨酸羟化酶，该酶能够在2-酮戊二酸和2价铁离子存在下，使游离的L-脯氨酸羟基化生成C3HP。

本发明通过将P3H与高效启动子组合，实现在宿主菌中大量表达该羟化酶。通过提供所需的碳源、氮源、微量元素等，将L-脯氨酸羟基化生成C3HP。

下面，详细地说明本发明生产C3HP的方法。

本发明所述的重组微生物的构建方法是合成P3H，然后用限制酶类处理合成的P3H，做成合适的DNA片段，插入到表达载体中启动子的下游，构建可大量表达顺式-3-脯氨酸羟化酶的重组质粒，将重组质粒导入到合适的宿主微生物中，得到产C3HP的重组微生物。载体中的启动子只要是能在宿主菌中表达的即可，可以是载体自带的启动子，如T7启动子或者Lac Z启动子，以及大肠杆菌或噬菌体等的启动子。也可以是外源的启动子，经过一定处理连接到表达载体上，如色氨酸串联启动子Ptrp2。

作为表达载体可以使用任何能在宿主菌中独立进行复制或者可与宿主染色体发生重组的载体。例如有pET系列质粒、pUC19质粒、PES质粒、pAMP质粒、pk18mobsacB质粒等。作为宿主，可以表达目的基因的都可以使用，例如除了大肠杆菌属，棒状杆菌属等属的微生物菌株外，还可以使用酵母菌株等。

顺式-3-脯氨酸羟化酶结构基因只要是编码顺式-3-脯氨酸羟化酶的基因都可以作为目的基因使用。例如来源于链霉菌TH1(Streptomyces sp.TH1)的编码顺式-3-脯氨酸羟化酶的基因等。为了使P3H在宿主中表达，在基因合成前首先要经过基因优化，使其更适于在宿主中表达。以大肠杆菌为宿主，通过一些在线工具，如JCAT，优化了P3H，然后通过同义替换等方法消除一些在大肠杆菌中使用频率低的密码子，优化mRNA的二级结构，使得核糖体能够顺利地沿着起始密码子向后翻译。

对于如上所述构建的重组微生物，进行培养的培养基只要是含有宿主可以利用的物质，并能有效对宿主进行培养的培养基，无论是天然培养基或者合成培养基皆可。例如对于用大肠杆菌作为宿主的微生物，只要培养基中含有可以利用的碳源、氮源、无机盐等，可以表达有活性的顺式-3-脯氨酸羟化酶的培养基都可以。

作为碳源，只要是微生物可以利用的均可以，如常见的淀粉、淀粉水解中间物、蔗糖、葡萄糖和半乳糖等，也可有机酸(如醋酸、丙酸)和醇类(如乙醇、甘油)。作为氮源，可以使用各种有机酸或者无机酸的铵盐及任何含氮化合物。作为无机盐，可以使用磷酸盐、硫酸镁和钾盐等。必要时可以添加一定的微量元素。

微生物的培养只要氧气量、温度、pH等条件适宜即可。大部分微生物需要在震荡或者通气搅拌等好氧条件下培养，培养温度最好在15～40℃、pH维持在3.0～9.0，此外，培养时间为12～100小时。根据需要，还可向培养基中添加氨苄青霉素、卡那霉素等抗生素。