[发明专利]一种强化解脂亚洛酵母合成α-酮戊二酸的方法

权利要求书

1.一种α-酮戊二酸合成强化的重组解脂亚洛酵母，其特征在于，是在解脂亚洛酵母中过量表达谷氨酸脱氢酶，强化谷氨酸供应。

2.根据权利要求1所述的重组解脂亚洛酵母，其特征在于，编码所述谷氨酸脱氢酶的基因来源于酿酒酵母。

3.根据权利要求1或2所述的重组解脂亚洛酵母，其特征在于，以解脂亚洛酵母为出发菌株，以含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载体p0为表达载体，表达核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的基因。

4.一种强化解脂亚洛酵母合成α-酮戊二酸的方法，其特征在于，通过在解脂亚洛酵母中过量表达谷氨酸脱氢酶，强化谷氨酸脱氢酶活力，强化谷氨酸供应、增强α-酮戊二酸积累。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在解脂亚洛酵母发酵产α-酮戊二酸过程中外源添加谷氨酰胺合成酶抑制剂L-蛋氨酸亚胺，降低细胞内谷氨酸分解代谢。

6.一种构建权利要求1所述重组解脂亚洛酵母的方法，主要包括以下步骤：(1)构建表达目的基因所用的整合型表达载体：扩增潮霉素磷酸转移酶hph基因，hph基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用限制性内切酶Stu I与Hind III同时处理扩增得到的hph基因和p0质粒，并连接两酶切产物得到含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载体p0(hph)；(2)构建重组整合型表达质粒：全化学合成编码谷氨酸脱氢酶的编码基因GDH2的开放阅读框序列，利用限制内切酶Sfi I和Not I切割GDH2的开放阅读框和整合型表达载体p0(hph)，连接获得重组表达质粒p0(hph)-GDH2；(3)将所得的p0(hph)-GDH2质粒转化Y.lipolytica WSH-Z06，验证筛选阳性转化子，获得重组解脂亚洛酵母。

7.一种应用权利要求1所述重组解脂亚洛酵母发酵生产α-酮戊二酸的方法，其特征在于，是将所得重组解脂亚洛酵母活化后接种到发酵培养基中，28-30℃、200-220rpm，培养144-168小时。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基含有：甘油100g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，NaCl 0.5g/L，K₂HPO₄ 0.1g/L，盐酸硫胺素2×10^-7g/L，调pH为5.0后再加入20g/L CaCO₃。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵培养基添加了L-蛋氨酸亚胺。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵培养基含有L-蛋氨酸亚胺36.1mg/L，甘油100g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，KH₂PO₄3g/L，MgSO₄·7H₂O 1.2g/L，NaCl 0.5g/L，K₂HPO₄0.1g/L，盐酸硫胺素2×10^-7g/L，调pH为5.0后再加入20g/L CaCO₃。