[发明专利]一种强化解脂亚洛酵母合成α-酮戊二酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种强化解脂亚洛酵母合成α-酮戊二酸的方法，尤其是一种通过调节细胞内氨基酸代谢强化α-酮戊二酸合成的方法，属于代谢工程领域。

背景技术

α-酮戊二酸作为微生物细胞内三羧酸循环(TCA)途径中重要中间产物之一，参与微生物细胞的多种代谢活动。不仅是三羧酸循环中的关键节点，在生物体内参与氨基酸、蛋白质、维生素的合成以及能量代谢，与三羧酸循环中其他代谢中间产物相比，α-酮戊二酸在微生物细胞内代谢积累受到多种调控作用。因此，揭示α-酮戊二酸在微生物细胞内代谢积累及调控机制具有重要的研究意义，并对强化细胞内其他三羧酸循环中代谢产物积累具有指导意义。α-酮戊二酸是重要的化工合成中间体，在氨基酸、维生素和其它小分子物质合成，在医药、有机合成、营养强化剂等领域都有着重要的应用前景。传统化学合成法生产该有机酸因合成线路长，反应过程复杂，而且利用氰化物等对人体有毒害化合物阻止了化学合成法生产的α-酮戊二酸在医药和食品等高附加值产品中的应用。利用微生物法发酵生产α-酮戊二酸不仅能减少对化石能源供应的依赖，并且以可再生的生物质为原料具有环境友好，经济可以持续性等优点。

微生物法生产α-酮戊二酸过程中存在目标代谢产物浓度低、生产强度低等不利因素。本发明通过削弱微生物细胞消耗α-酮戊二酸合成氨基酸，来强化α-酮戊二酸的合成积累。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种α-酮戊二酸合成强化的重组解脂亚洛酵母，是在解脂亚洛酵母出发菌株中过量表达谷氨酸脱氢酶，强化谷氨酸脱氢酶活力，强化谷氨酸供应，增强α-酮戊二酸积累。

在本发明的一种实施方式中，编码所述谷氨酸脱氢酶的基因来自酿酒酵母。

在本发明的一种实施方式中，编码所述谷氨酸脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组解脂亚洛酵母是以解脂亚洛酵母为出发菌株，以含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载体p0为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述解脂亚洛酵母是解脂亚洛酵母WSH-Z06 CCTCC NO：M20714。

在本发明的一种实施方式中，所述质粒p0的构建方法参见文献：Swennen D,Paul MF,Vernis L,Beckerich JM,Fournier A,Gaillardin C.Secretion of active anti-Ras single-chain Fv antibody by the yeasts Yarrowia lipolytica and Kluyveromyces lactis.Microbiology-Sgm,2002.148:41-50。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种强化解脂亚洛酵母合成α-酮戊二酸的方法，是调节细胞内氮源代谢，通过在解脂亚洛酵母出发菌株中过量表达谷氨酸脱氢酶，强化谷氨酸脱氢酶活力，强化谷氨酸供应、增强α-酮戊二酸积累。

在本发明的一种实施方式中，为增强细胞内谷氨酸的供应，还可以外源添加谷氨酰胺合成酶抑制剂L-蛋氨酸亚胺，降低细胞内谷氨酸代谢分解，强化谷氨酸供应、增强α-酮戊二酸积累。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种构建所述重组解脂亚洛酵母的方法，主要包括以下步骤：(1)构建表达目的基因所用的整合型表达载体：扩增潮霉素磷酸转移酶hph基因，hph基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，利用限制性内切酶Stu I与Hind III同时处理扩增得到的hph基因和p0质粒，并连接两酶切产物得到含有潮霉素转磷酸移酶为筛选标记的整合型表达载体p0(hph)；(2)构建重组整合型表达质粒：根据NCBI公开的序列，全化学合成编码谷氨酸脱氢酶的编码基因GDH2的开放阅读框序列，利用限制内切酶Sfi I和Not I切割GDH2的开放阅读框和整合型表达载体p0(hph)，连接获得重组表达质粒p0(hph)-GDH2；(3)将所得的p0(hph)-GDH2质粒转化Y.lipolytica WSH-Z06：利用电穿孔转化方法将被限制性内切酶Avr II线性化的重组整合型表达质粒转化野生型Y.lipolytica WSH-Z06，提取转化子基因组，利用验证引物对VBF/V-GDH2验证筛选阳性转化子，获得Y.lipolytica-GDH2菌株。