[发明专利]一种达托霉素杂质RS‑2高纯度样品的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物发酵制药领域，涉及一种抗生素产品中的相关杂质的制备方法，尤其涉及达托霉素相关杂质RS-2的高纯度样品的制备方法。

背景技术

达托霉素是自链霉菌(S.reseosporus)发酵液中提取得到一种全新结构的环脂肽类抗生素，它通过扰乱细胞膜对氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变细胞质膜的性质，能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，并迅速杀死革兰氏阳性菌。达托霉素除了能作用于大多数临床相关革兰氏阳性菌外，更重要的是它在体外对已呈现甲氧西林(methicillin)、万古霉素和利奈唑烷等耐药性质的分离菌株具有强力活性，这个特性对于危重感染患者具有非常重要的临床意义。

达托霉素相关杂质RS-2是达托霉素质量控制中重点关注的杂质，高纯度的杂质样品对RS-2杂质研究有重要作用。

根据“国家食品药品监督管理局进口药品注册标准”(标准号JX20070250)关于注射用达托霉素的描述，将高压液相检测达托霉素时候，在保留时间19.9分钟，相对达托霉素保留时间0.56的杂质命名为RS-2。

高压液相检测条件：

色谱柱：Phenomenex IB-sil 250×4.6mm

填充填料：C8，粒径5μm

流动相：0.45％磷酸二氢铵pH3.25(磷酸调节)的溶液(V)∶乙腈(V)＝67:33

流速：1.5mL/min

检测波长λ：214nm

其中RS-2的产品量为用达托霉素作为标准品，通过面积归一法计算得到的一个方便我们衡量上柱量的相对的数值。

RS-2在达托霉素成品中含量非常低，一般不超过0.3％，C8填料制备柱分离制备此杂质需要消耗大量的达托霉素成品及大量的流动相，制备成本非常高昂。

发明内容

本发明提供了一种方法，可以快速且成本低廉的制备高纯度的RS-2。

一种达托霉素杂质RS-2高纯度样品的制备方法，其步骤包括：

1)收集达托霉素生产上FPDA树脂层析的预洗液，用超滤机进行超滤，去除大分子的色素及蛋白；

2)将步骤1)超滤后的滤液用纳滤机进行浓缩；

3)将步骤2)得到的浓缩液上硅胶柱并解吸，所用解吸液包含异丙醇、一种水溶性有机溶剂和一种盐的水溶液，解吸液可按照每1/10柱床体积收集一瓶备用；

4)通过高压液相色谱检测收集到的解吸液中RS-2杂质含量，将RS-2杂质纯度≥95％的解吸液合并；

5)将合并的解吸液用纳滤机进行浓缩并脱盐，直到纳滤废水中的电导率≤20μS/cm；

6)将纳滤浓缩液放入冻干机冻干，得到高纯度的RS-2杂质的粉末。

上述步骤2)浓缩后的浓缩液优选为预洗液体积的1/180～1/200。

上述步骤3)中使用的硅胶优选为分析纯级别层析硅胶，其粒径为200～300目；硅胶采用异丙醇浸泡装柱。干硅胶用量为杂质RS-2产品量的2000～2010倍重量。

上述步骤3)中，解吸液中所述一种水溶性有机溶剂优选为甲醇或乙醇，所述一种盐的水溶液优选为乙酸铵或氯化铵的水溶液。其中所述乙酸铵水溶液的浓度优选为0.4～0.43％(g/L，即每100mL溶液中含有0.4～0.43g乙酸铵)，并用乙酸调节溶液pH为3.4～3.6；所述氯化铵水溶液的浓度优选为0.24～0.26％(g/L)，并用盐酸调节溶液pH为3.4～3.6。

异丙醇和所述水溶性有机溶剂、盐的水溶液按一定比例混合成解吸液，在本发明的一些具体实施例中，按体积比它们的混合比例为：异丙醇∶乙醇∶乙酸铵水溶液＝(9～10):(11～13):(6～8)；或者异丙醇∶甲醇∶氯化铵水溶液＝(9～10):(8～10):(5～7)。

上述步骤5)中脱盐的方法为：当所有解吸液都收入纳滤机后，向其中加入pH＝4.4～4.6的醋酸水溶液，直到纳滤废水中的电导率≤20μS/cm，停止加醋酸水溶液。纳滤后浓缩液体积控制在100～200mL为佳。

本发明提供的达托霉素杂质RS-2高纯度样品的制备方法工艺简单，相比于现有技术通过制备柱分离的方法节约了大量成本。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。