[发明专利]检测人ApoE‑ε4蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于多肽化学和免疫学领域，具体涉及人载脂蛋白E-ε4(ApoE-ε4)抗原表位肽、用该抗原表位肽制备的ApoE-ε4特异性抗原和相应的单克隆抗体或多克隆抗体、所述抗体在制备人ApoE-ε4体外诊断试剂盒上的应用，人ApoE-ε4体外诊断试剂盒，以及一种用于定量检测待测物中人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。

背景技术

老年性痴呆(Alzheimer’s disease,AD)是一种原发性大脑退行性疾病，已经成为人类继心血管病、癌症、中风之后的第四大杀手。按目前的医疗水平，对于AD的治疗，只能延缓早期患者的病情发展，对中晚期的患者尚无有效的治疗方法。因此，早期诊断、早期干预、延缓病情发展成为AD治疗的关键。近年来，对老年性痴呆早期诊断的研究已经引起许多研究者的注意，寻找一种有效的、可靠的、非侵入式的、生化检测手段是众多研究者的共同心愿。ApoE-ε4就是这样的一种生化标志物。

ApoE是研究较多的基因，也是影响老化途径的最重要的遗传因素之一，ApoE-ε4基因携带者是公认的AD致病因素。研究发现，19号染色体上的载脂蛋白E(ApoE)基因的ε4等位基因是AD的准风险因子,且二者之间存在着剂量依赖效应。因此，通过在血清中检测载脂蛋白E，可以判断AD。因此，ApoE-ε4有希望作为AD诊断的标志物。

检测血清中的ApoE水平的最理想的方法为免疫检测。因此，寻找合适的具有免疫原性的ApoE抗原表位肽、制备特异性的ApoE抗原及抗体即成了重点。

荧光免疫层析方法测血液中的待测物操作简便、快速，只需10分钟就能完成样品检测，并且检测范围宽，灵敏度好，能够迅速及时地帮助诊断病情，监测预后。中国专利申请No.200910117820.8公开了一种荧光微球免疫层析试纸条的制备方法及定量检测方法；中国专利申请No.200910047352.1公开了一种荧光免疫层析试纸及其制备方法和应用。然而，目前还没有针对人ApoE蛋白的荧光免疫层析试纸。

发明内容

为解决上述现有技术中所存在的问题，本发明提供了一种用于定量检测待测物中人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸及其制备方法。

具体而言，本发明提供了：

一种用于定量检测待测物中人ApoE-ε4蛋白的荧光免疫层析试纸，该试纸通过双抗体夹心法检测所述人ApoE-ε4蛋白，其中：

所述双抗体夹心法采用标记有荧光微球的第一ApoE-ε4单克隆抗体作为捕获抗体，所述第一ApoE-ε4单克隆抗体来源于人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的一者；并且

所述双抗体夹心法采用第二ApoE-ε4单克隆抗体作为检测抗体，所述第二ApoE-ε4单克隆抗体来源于人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的另一者；

所述人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)分别为：

(1)Tyr-Lys-Val-Glu-Gln-Ala-Val-Glu-Thr-Glu-Pro-Glu-Pro-Glu-Leu-Arg；

(2)Tyr-Ser-Arg-Thr-Arg-Asp-Arg-Leu-Asp-Glu-Val-Lys-Glu-Gln-Val-Ala-Glu-Val-Arg-Ala-Lys。

优选地，所述第一ApoE-ε4单克隆抗体是由第一ApoE-ε4抗原制备而成的，该第一ApoE-ε4抗原是通过使所述人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的一者与载体蛋白偶联制备而成的；并且

所述第二ApoE-ε4单克隆抗体是由第二ApoE-ε4抗原制备而成的，该第二ApoE-ε4抗原是通过使所述人ApoE-ε4抗原表位肽(1)和(2)中的另一者与载体蛋白偶联制备而成的。

优选地，所述荧光微球的粒径为320nm至400nm。

优选地，所述荧光微球上的荧光物质为异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或X-罗丹明等，其中优选为X-罗丹明；所述荧光微球的微球材料为聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸甲酯的共聚物。

优选地，所述荧光微球的激发波长为350～600nm，优选为390nm；发射波长为500～700nm，优选为615nm。