[发明专利]H5N1型禽流感病毒的NS1-C端截短蛋白、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别提供了一种H5N1型禽流感病毒的NS1-C端截短蛋白、其制备方法及应用。

背景技术

禽流感是由A型流感病毒(Avian influenzavirus，AIV)引起从呼吸系统病变到全身败血症的高度接触性急性传染病。由于H5N1禽流感病毒绝大多数人对其没有免疫力，以及其引起的严重感染和高死亡率，有可能引起世界范围的大流行，并造成很严重的后果。

禽流感病毒是一种A型流感病毒，其基因组由8个节段的单股负链RNA构成，共编码11种蛋白。NS1蛋白由第8节段RNA编码而成，共编码202-237个氨基酸，相对分子量约为28kDa。NS1蛋白主要包括两个结构域，即N-末端的RNA结合结构域(RNA-binding domain,RBD)和C-末端的效应结构域(effector domain,ED)。NS1蛋白大部分氨基酸序列保守，但是RNA结合域和效应域之间的连接区域及羧基末端因毒株不同序列信息有所差异，大多数H5N1(超过90％)第80-84位氨基酸残基缺失。NS1蛋白被认为与H5N1高致病禽流感在感染细胞中产生高水平促炎症反应因子相关。已有多个NS1-C末端结构域的晶体结构被解析。目前发现几乎所有A型流感病毒NS1-C单体链折叠方式基本相同，但其二聚体相互作用模式存在差别，除α-α螺旋和β-β折叠股相互作用外，科学家还发现第三种作用模式，这可能与病毒毒株有关。NS1蛋白是一种多功能调节蛋白，具有抑制宿主蛋白合成、促进病毒RNA合成和成熟、拮抗干扰素产生、影响细胞凋亡等功能，在调节流感病毒致病性及毒力方面发挥着重要的作用。目前越来越多的针对禽流感病毒致病机理的研究把目光投向了NS1蛋白。

人禽流感严重威胁着人类的公共健康，而对其致病机理知之甚少，因此，研究NS1蛋白是理解禽流感致病性的关键，同时为在流感病毒治疗药物筛选的靶位研究中做出巨大贡献。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于提供一种H5N1型禽流感病毒的NS1-C端截短蛋白、其制备方法及应用，其确定了NS1-C端蛋白与人体NOLC1蛋白相互作用的精确区域，为研究禽流感病毒的致病机制和研究药物筛选的靶位点提供重要基础。

本发明提供了一种H5N1型禽流感病毒的NS1-C端截短蛋白，其特征在于：其具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸。

本发明还提供了一种编码上述NS1-C端截短蛋白的基因，其特征在于：其具有SEQ ID NO.2所示的序列。

本发明还提供了一种含有上述NS1-C端截短蛋白或上述基因的重组表达载体，其为将SEQ ID NO.2所示序列的核苷酸连入pEGFP-N1载体的EcoRI和BamHI酶切位点而得。

本发明还提供了一种含有上所述重组表达载体的工程菌。

本发明同时还提供了上述重组表达载体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

1)使用同源建模软件以禽流感病毒菌株的NS1蛋白晶体结构为模板，构建目标禽流感病毒NS1-C端区域空间结构；

2)在选定的NS1-C端区域的上下游分别引入EcoRI和BamHI酶切位点，设计截短体引物，进行截短体PCR扩增；

3)将PCR产物纯化后与pEGFP-N1载体分别进行双酶切，回收酶切产物进行连接；

4)将连接产物转化至大肠杆菌DH5α；

5)取转化平板上的阳性菌落，转接LB液体培养基中，37℃过夜培养，用试剂盒进行质粒的提取；

6)通过双酶切和测序鉴定，得到阳性重组质粒。

其中，所述截短体引物具体为：

正向引物F1:5’-ccggaattctaatgtcatcggaggacttgaatgg-3’

反向引物R1:5’-cggggatcccgaacttttgactcaattgttctc-3’。

所述禽流感病毒菌株为A/chicken/Hubei/327/2004(H5N1)菌株。

本发明最后还提供了一种上述NS1-C端截短蛋白或上述基因或上述重组表达载体在流感病毒治疗药物中的应用。

本发明提供的H5N1型禽流感病毒的NS1-C端截短蛋白、其制备方法及应用，确定了NS1-C端蛋白与人体NOLC1蛋白相互作用的精确区域，对我们进一步研究流感病毒治疗药物筛选的靶位提供了实验基础，也为了解NOLC1蛋白的结构学和功能学提供帮助。

附图说明

图1为目标禽流感病毒NS1-C端区域空间结构意图；