[发明专利]一种pTerm-SC质粒及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术及基因工程领域，具体涉及一种低拷贝、大容量、高稳定性的pTerm-SC质粒及其构建方法和应用。

背景技术

质粒是染色质外的遗传因子，能够进行自主复制，是一种能独立复制的复制子。质粒是一种双链共价闭合环形DNA分子，可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2kb-300kb之间。

质粒虽然不是宿主生存所必需的遗传元件，但是能够给予宿主细胞某些特殊的性质，例如抗药性等。质粒可以作为载体用于克隆外源基因，广泛应用于基因克隆、测序及基因合成等领域。人们一方面不断从自然界发现新质粒，另一方面也不断在已有质粒的基础上构建衍生质粒，作为基因工程的载体。

所谓复制子，即是一个遗传单位，包括DNA复制起点(ori)及其相关的调控原件。每个质粒DNA上都含有ori，在质粒中ori是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，只有ori能被宿主细胞复制及蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与ori的序列结构相关。

根据质粒复制的特点，质粒被分为严紧型和松弛型两类。严紧型质粒也称低拷贝数质粒，每个细胞中拷贝数有限，大约一个至十几个；松弛型质粒也称高拷贝数质粒，其拷贝数较多，可达几百个。恒定的拷贝数与质粒复制控制系统、宿主细胞遗传背景及生长条件有关。尤其是高拷贝数质粒更是因其分子量小、拷贝数高、操作方便、易于大量制备等优点而成为实验中的首选。

质粒复制控制系统首先通过调节ori来控制拷贝数，调节因素包括阻遏蛋白、反义RNA和某些顺向重复序列等，一旦质粒上与调控有关的基因位点突变，可使拷贝数明显增加或减少。在质粒复制时，首先合成前RNAⅡ即前引物，并与DNA形成杂交体；而后RNase H切割前RNAⅡ，使之成为成熟的RNAⅡ，并形成三叶草二级结构，该引物引导质粒的复制。形成的RNAⅠ可控制RNAⅡ形成二级结构，同时Rop增强RNAⅠ的作用，从而控制质粒的拷贝数。削弱RNAⅠ和RNAⅡ之间相互作用的突变，将增加带有pMB1或(ColE1)复制子的拷贝数。

松弛型质粒(高拷贝数质粒)通常带有蓝白斑筛选功能(例如pUC系列载体)，这个特点给基因克隆带来了极大的方便。用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz＇的基因，lacz＇中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子序列；编码α肽链的序列；一个多克隆位点(MCS)。MCS位于编码α肽链的序列中，是外源DNA的插入位点。设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株，这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽(即α肽链)，从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的N端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用，能够使X-gal生成蓝色物质，这种现象即α-互补。以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源DNA与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生有活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型呈现白色菌落。

虽然带有蓝白斑筛选功能的高拷贝数质粒给基因克隆提供了极大的方便，但是其β-半乳糖苷酶的启动子属于强启动子，能够大量启动外源基因的转绿、翻译，这也导致了某些结构复杂的基因、转录或翻译产物对宿主有毒性的基因无法克隆。目前通常使用以下两种方式克隆这类“难度”基因：①选用低拷贝或单拷贝质粒作为克隆载体；②选用可以降低质粒拷贝数的菌株，例如EPI400。尽管这些方法可以成功克隆部分“难度”基因，但是仍有很多基因无法克隆，究其原因是因为这些载体尽管拷贝数低，但是通常还是带有蓝白斑筛选功能，仍具有大量启动外源基因的转绿、翻译的强启动子，并且即使质粒中不带有蓝白斑筛选功能，不具有相应的强启动子，质粒中其它启动子(例如抗生素抗性基因启动子)也可以启动外源基因的低量转录、翻译，因此，如何克服现有质粒载体存在的上述缺陷，提高克隆“难度”基因的成功率是很多科研人员需要解决的首要问题。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种能够有效遏制外源基因的转录、翻译，更为稳定的低拷贝书细菌致育因子(Fertility factor)衍生载体pTerm-SC质粒，并进一步公开其构建方法及应用。