[发明专利]谷子白发病菌LAMP快速检测方法的建立

说明书

技术领域

本发明属于植物真菌分子生物学检测技术领域，具体涉及用LAMP技术对谷子白发病菌进行检测。

背景技术

谷子白发病在我国主要谷子栽培区普遍发生，一般导致减产1%-5%，严重的达50%以上。其症状随生长时期的变化而不同。谷子自开始萌芽一直到成熟，各期随时发生不同的症状。若谷子在种子萌芽期被病原菌侵染，则幼苗在不及伸达土面时就发生变色弯曲，随后被腐生菌侵害，最终腐烂。待抽穗时，病株抽出的穗呈深褐色，并伴有各种形式的畸形。病穗上的花也畸形发展，内外颖伸长卷曲作角状或叶状，使穗上长出许多丛生的叶状侧生枝，病穗变得疏松并包含小而扭曲的绿色叶片，形成绿穗。病穗的花器发育成叶片状蘖，雄蕊和雌蕊不能正常发育。病穗部分不结子实。

谷子白发病病原菌最早是在轮枝狗尾草（Setaria verticillata）上发现的，当时被命名为Protomyces graminicola，后来发现它是霜霉菌科的一个新属，Sclerospora，因此命名为Sclerospora graminicola。谷子白发病菌的寄主包括禾本科作物如谷子，高粱，甘蔗等，以及禾本科牧草如金狗尾草，青狗尾草，狼尾草，草原梯牧草等。谷子白发病菌有两个世代，无性生殖世代即游动孢子囊世代，有性生殖世代即卵孢子世代。白发病菌的菌丝生长在细胞间隙，侧生的圆形吸盘伸到细胞里面吸取营养，起初产生游动孢子囊梗，在其上产生游动孢子囊。发育到一定阶段后，菌丝产生精子器和藏卵器，交配后形成卵孢子。

环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是日本学者Notomi等人于2000年开发的一种新型恒温核酸扩增技术。该技术针对靶基因的6个特定区域设计内外2对特异性引物，利用具有链置换作用的DNA聚合酶在恒温条件下特异的扩增靶序列，具有特异性强、灵敏性高、经济、简单的特点。目前，LAMP技术已广泛应用于食品及农业等领域。例如何旭峰等人建立了一种基于LAMP技术，从植物罹病组织中直接检测象耳豆根结线虫的方法，为象耳豆根结线虫的监测和防治提供技术支持（何旭峰等，植物罹病组织中象耳豆根结线虫的LAMP快速检测方法.中国农业科学,2013，46(3)：534-544）；黄丽等人利用LAMP技术对柑橘黄龙病田间疑似样品进行了检测，LAMP阳性检出率为52.4%，而常规PCR为37.1%（黄丽等，柑橘黄龙病LAMP快速检测方法的建立与应用.果树学报,2012，29(6)：1121-1126）。由于谷子白发病的初侵染源主要是带病的种子，因此控制种子是最经济有效防治该病的方法。本研究基于LAMP技术，建立了一种从谷子种子中快速检测谷子白发病菌的方法，该方法的建立有利于控制谷子白发病的发生。

发明内容

本发明基于18S rDNA基因建立了一种谷子白发病菌的LAMP快速检测方法。 

本发明的具体步骤是：

1、PCR扩增谷子白发病菌18S rDNA序列

提取谷子白发病菌基因组DNA，根据植物病原真菌18S rDNA基因区通用引物LROR(5'-ACCCGCTGAACTTAAGC -3')和LR5(5'-TCCTGAGGGAAACTTCG -3')扩增谷子白发病菌18S rDNA基因，扩增后的特异性片段切胶回收，通过克隆转化把插入目的片段的克隆送上海生工进行测序。最终，获得1159bp的谷子白发病菌18S rDNA特异性片段SEQ ID No.1。测序结果与NCBI上所公布的藻界卵菌门18S rDNA基因具有高同源性，因此克隆得到的基因为谷子白发病菌18S rDNA基因序列。

2、LAMP特异性引物设计

根据谷子白发病菌18S rDNA序列测序结果，应用Primer Premier 5.0软件设计了两对特异性引物序列SEQ ID No.2，SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，SEQ ID No.5，序列如下：

SEQ ID No.2   F3：GCGTGCGTGTACTATGGC

SEQ ID No.3   B3：GTTGTAGGCACCTCAGTCC

SEQ ID No.4  FIP：GGCGTCCCACCACAATACAGGCTTTTTGGCTGCGCTTGG

SEQ ID No.5  BIP：ACCGCGGGAAATGACTACCGAAACCACAACTACTCGTCCAC。

3、引物特异性检测