[发明专利]一种分离、纯化金钗石斛原生质体的方法和专用试剂配方

权利要求书

1.一种分离、纯化金钗石斛原生质体的专用试剂配方，其特征在于：专用试剂溶液A和溶液B， A由MES、KCl、Mannitol、Cellulase R10、Pectolyase Y-23、Macerozyme R-10、BSA、CaCl₂和ddH₂O；溶液B由MES、KCl、Mannitol、BSA、CaCl₂、ddH₂O；

溶液A成分及含量以10 ml如下：

所述试剂溶液A各成分浓度为：MES 0.2 mol/L，Mannitol 0.30-0.95 mol/L，KCl 0.08 mol/L，CaCl₂ 0.10-0.30 mol/L；

溶液B成分及含量以10ml如下：

  所述试剂溶液B各成分浓度为：MES 0.2 mol/L，Mannitol 0.30-0.95 mol/L，KCl 0.08 mol/L，CaCl₂ 0.10-0.30 mol/L。

2.一种分离、纯化金钗石斛原生质体的方法，其方法步骤和特征在于：

一）原生质体的分离：1）将金钗石斛再生苗植株或成株放置在黑暗条件下培养12 h，取幼嫩饱满叶片在超净工作台中经无菌处理后将其切割为1 mm左右宽的碎片后进行预处理，即置于盛有0.30-0.95 mol/L甘露醇的培养皿中，在4 ℃低温、黑暗条件下质壁分离1 h后倒掉甘露醇溶液；

2）注入溶液A对预处理后的叶片碎片进行避光酶解，在温度23-28 ℃、转速为50-150 rpm的恒温摇床上震荡0.5-6 h即可释放出原生质体；本步骤中，注入溶液A的量根据叶片碎片的多少来决定，以溶液A刚好淹没叶片碎片小段为宜；培养皿需用封口胶封口以避免染菌；培养皿在恒温摇床上震荡，使溶液A与叶片碎片充分接触；

3）溶液A酶解完成后，打开培养皿，用吸头轻轻吹打叶片，即可充分释放出酶解出来的原生质体；

二）原生质体的纯化：将酶解0.5-6 h左右原生质体混合液用200目的细胞筛过滤，再将滤液置于2 ml离心管中，在100-500 g/min下离心2-8 min，使原生质体沉降，然后弃上清夜，将溶液B缓慢加入沉降物中进行轻轻重悬，在100-500 g/min的转速下离心2-5次，每次2-8 min，最终得到纯化的原生质体 ；

三）原生质体产量的测定：将纯化后的原生质体转入溶液B中，定量成2 ml，轻轻吹打，使原生质体分布均匀；取一块干净的血球计数板，盖上盖玻片，用移液枪吸取一滴原生质体液加在盖玻片一侧边缘，待液体充满计数区，置于倒置显微镜下计数，连续计数三次，每次重复数三遍，取平均值；根据加入溶液A中叶片的多少计算出每克叶片得到的原生质体的产量，计算结果以每克叶片细胞数表示（个/g）；

四）原生质体活力的鉴定：利用FDA（荧光素双醋酸酯）透过原生质体后，在酯酶的作用下迅速分解，放出荧光素，使有活力的原生质体发出黄绿色的荧光从而来鉴定原生质体的活力，计算原生质体活力时需在明视野下观察原生质体总数，然后再转到荧光下记录有活力的原生质体数，最后计算原生质体活力率。