[发明专利]一种分离、纯化金钗石斛原生质体的方法和专用试剂配方

说明书

技术领域

本发明涉及植物细胞工程领域，具体为用金钗石斛的幼嫩叶片分离、纯化原生质体的方法与相应的专用试剂配方。本发明为一种金钗石斛原生质体分离与纯化的方法与专用试剂。使用包括以下步骤：原生质体的分离、原生质体的纯化、原生质体产量的测定、原生质体活力率的测定。

技术背景

金钗石斛（Dendrobium nobile Lindl.）在治疗白内障、益胃生津、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、治疗心血管疾病、提高机体免疫功能、抗疲劳等方面具有显著功效，在国内外具有广阔的市场，已成为世界各国防病、治病和医疗保健的极品良药。然而，由于金钗石斛自然生长缓慢的自身原因、生长环境被破坏的环境原因和长期被掠夺式采挖的人为原因，导致其资源日益匮乏，已被列为国家二类保护植物和《国家重点保护野生植物名录》，迫切需要借助现代生物技术，（1）保护和利用现有的种质资源、（2）创制新的种质资源为选育优良品种奠定材料基础、（3）利用细胞悬浮培养或转基因工程菌方式生产药用成分以缩短有效成分的获取周期。分离纯化出高活力的原生质体，进一步通过细胞工程方法对金钗石斛进行遗传改良具有重要的研究价值和市场潜力。

植物原生质体是指除去了全部细胞壁后质膜包裹的细胞，是开展基础研究的理想材料。分离纯化的原生质体，可以用于开展植物细胞信息传递、能量转换、细胞壁合成机理、膜的结构与功能、核质关系、突变体诱导、杂交或自交不亲和的机理、细胞间的相互作用、植物激素的作用机理、分离各种细胞器、引入细胞器、原生质体转化导入外源基因、生物反应器构建等方面的研究。

本发明人首先搜集了多个金钗石斛的种质资源，进行评价后，用源自赤水的金钗石斛种源的种子为外植体，通过植物组培技术进行种子萌发、原球茎诱导和组培再生苗培养，系统建立起种苗的组培快繁技术体系，再以组培再生苗的叶片为材料，用酶解法分离获得了原生质体，并进行了纯度和活力检测。进一步以云南瑞丽的一个金钗石斛品系和赤水金钗石斛另一个品系的嫩叶为研究材料，以本技术方法和试剂进行原生质体分离纯化，均能获得纯度高、活力强的原生质体，为金钗石斛的种质资源拓展、商业化遗传育种、基因改良等后续研究奠定了一定的物质基础。

国内外迄今检索到的、关于金钗石斛原生质体分离的报道有两份。一份是刘运全等（2010）以金钗石斛类原球茎为研究材料，用酶解法获得了（8.25±0.17）×10⁵个/g、活性为（90.24±1.84）%原生质体的报道（刘运全等,2010,热带生物学报 1(3):215-219），而本专利用采用的材料为金钗石斛组培苗或成株的幼嫩叶片，分离原生质体的溶液配方和操作流程与刘运全等的也基本不同，但本专利获得的原生质体得率可达7.55×10⁷个/g叶片，远高于该文献报道，且本专利获得的原生质体活力率均达90%以上，最高可达92.38%，与该文献比较而言相当或更高。

另一份文献是本实验室之前申报的一项专利，“一种赤水金钗石斛原生质体分离、纯化方法及专用试剂”（申报日期为2014年4月17日，专利受理号为201410153412.9），原生质体的得率为3.72×10⁷个/g叶片、活力率达86.13%。本专利在该文献基础上做了较大改进，使得原生质体的得率和活力率显著增加。与前一个专利文献比较，本发明专利做了如下重大改进：（1）本专利的使用不仅仅限制于组培苗的叶片，还可应用于田间种植植株的幼嫩叶片，但田间叶片在酶解前需灭菌处理；（2）本专利增添了简单的预处理步骤，以提高原生质体的得率和活力，具体为：在酶解叶片分离原生质体前，先将金钗石斛再生苗植株或田间种植的株放置在黑暗条件下培养12 h，取幼嫩饱满叶片在超净工作台中经无菌处理后将其切割为1 mm左右宽的碎片后置于盛有0.30-0.95 mol/L甘露醇的培养皿中，在4 ℃低温、黑暗条件下质壁分离1 h后倒掉甘露醇溶液；（3）本发明专利中溶液A与溶液B中关键试剂和实验流程中关键参数（如温度、转速、处理时间）是一定的幅度范围，而不是像前专利那样是某一个具体的数值，这使得实验时更便捷和更具有可操作性；（4）本专利的原生质体得率翻倍，活力也显著提高，分别达7.55×10⁷个/g和92.38%。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单易行且快速获取能满足细胞器分离与功能鉴定、转基因受体和生物反应器构建的金钗石斛原生质体的方法与专用试剂的配方。