[发明专利]艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒

权利要求书

1.一种艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）引物的设计：分别对艰难梭菌cdtA和cdtB重复序列通过BLAST软件进行同源性分析获得艰难梭菌特异保守序列，再根据艰难梭菌特异保守DNA序列，用软件Primer design V4设计分别得到用于对艰难梭菌cdtA和cdtB进行LAMP检测的引物；

（2）LAMP扩增：以待测物的基因组DNA为模板，在上述引物的引导下进行LAMP扩增；所述的待测物为人及动物的粪便或培养分离的菌株；

（3）扩增反应结束后进行结果判定：扩增反应前预先在反应液中添加钙黄绿素指示剂，根据反应后反应液的颜色变化判断结果，反应液的颜色变绿色表示待测物样品中存在艰难梭菌二元毒素，反应液的颜色变橙色表示待测样品中不存在艰难梭菌二元毒素；或者不添加钙黄绿素指示剂直接用浊度仪检测反应前后反应液的浊度变化来判断结果，反应液浊度上升表示待测物样品中存在艰难梭菌二元毒素，反应液浊度无变化表示待测样品中不存在艰难梭菌二元毒素。

2.根据权利要求1所述的艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法，其特征在于：经所述步骤（1）设计优化获得用于对艰难梭菌cdtA和cdtB进行LAMP检测的专用引物如下：

（1）用于对艰难梭菌cdtA进行LAMP检测的cdtA引物为以下三组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；第三组引物对：引物5（LF）与引物6（LB）；所述各引物序列如下：

F3：TCTGGTCCTCAAGAATTTGG

B3：AATAGCTGATAGATAAGCTCCA

FIP：GCTTGTCCTTCCCATTTTGATTTAATTTTTAACTCTTACTTCCCCTGA

BIP：ATTGGTAGTGTGAATATGAGTGCATTACCTTTAGGTATAGTTATACGTAGT

LF：AAATCATATTCAGGGGAA  

LB：TTTGCTAAAAGAAAAATAGTACTAC

所述cdtA引物中三组引物对（FIP和BIP）:（LF和LB）:（F3和B3）的摩尔比为8:4:1；

（2）用于对艰难梭菌cdtB进行LAMP检测的cdtB引物为以下两组引物对混合的引物组合，第一组引物对：引物1（F3）与引物2（B3）；第二组引物对：引物3（FIP）与引物4（BIP）；所述各引物序列如下：

F3：GAGTCAAATACTGCTGGAGA

B3：TAGTAGCTCTGGAAACAGTT

FIP：CGGATCTCTTGCTTCAGTCTTTTTTCAGATTATGAAAAAGCTTCAGGTT

BIP：AGTTGCAGCATATCCAATTGTTGGTTTCCTTGATCAGTAGAGGCATG

所述cdtB引物中两组引物对（FIP和BIP）:（F3和B3）的摩尔比为8: 1。

3.根据权利要求1或2所述的艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法，其特征在于：所述步骤（1）获得的引物按步骤（2）进行LAMP扩增的反应条件为：检测cdtA时，扩增反应在57-64℃下恒温90min；检测cdtB时，扩增反应在57-68℃下恒温90min。

4.根据权利要求3所述的艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法，其特征在于：所述LAMP扩增的反应条件为：检测cdtA时，扩增反应在60℃下恒温90min；检测cdtB时，扩增反应在63℃下恒温90min；同时检测艰难梭菌cdtA和cdtB的扩增反应条件为：61℃恒温90min。

5.根据权利要求1所述的艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法，其特征在于：所述钙黄绿素指示剂的添加量为1μl，所述钙黄绿素指示剂包含有0.5 mM钙黄绿素和10 mM 氯化锰。