[发明专利]艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种艰难梭菌二元毒素的LAMP检测方法及其专用引物与试剂盒，属于生物技术领域中细菌的分子生物学检测方法技术领域。

背景技术

艰难梭菌（Clostridium difficile，Cd）为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，广泛分布于水、土壤等自然环境及动物和人的粪便中。艰难梭菌是一种条件致病菌，本身没有侵袭性，当人体肠道正常微环境遭到破坏时，部分产毒细菌通过分泌毒素A、毒素B以及二元毒素引起抗生素相关性腹泻、结肠炎甚至致死性伪膜性肠炎，统称为艰难梭菌感染（Clostridium difficile infection，CDI）。

艰难梭菌可分为产毒株和不产毒株，不产毒株不引起临床症状。艰难梭菌产毒株的产毒因子主要包括毒素A和毒素B，由tcdA和tcdB编码，而tcdA和tcdB受负向调节基因tcdC、正向调节基因tcdD以及膜孔蛋白基因tcdE调节，以上基因共同构成了致病决定区。毒素A又称肠毒素，易导致回肠肠壁中性粒细胞浸润，释放淋巴因子，引起液体大量分泌和出血性坏死；毒素B又称细胞毒素，能使肌动蛋白解聚，损坏细胞骨架，导致细胞固缩坏死，直接损伤肠壁细胞。tcdC基因的多态性或部分碱基缺失可导致毒素A、B产生增加。此外，在北美洲和欧洲引起广泛暴发流行的027型艰难梭菌可以产生更强的毒素，即二元毒素（binary toxin，CDT）。CDT由CDT a 和CDT b这两种独立蛋白链组成，由致病性决定区外的2个染色体基因cdt A基因和cdt B基因编码。cdtA是一种ADP核糖转移酶，可阻断肌动蛋白片段的合成而诱导细胞死亡，cdtB是一种运输蛋白，被丝氨酸蛋白酶激活后，cdtB通过与宿主细胞结合，把cdtA转移至细胞液中，诱导细胞骨架解聚，生成微管突出物，增强艰难梭菌的定植。

据美国疾病预防控制中心报道，艰难梭菌共有150个PCR核酸型和24个毒素型，而毒力较强的菌株是027/B1/NAP1 （核酸电泳分型为027，限制性内切酶分型为BI，脉冲场凝胶电泳分型为NAP1），它产生毒素A、毒素B和CDT。该型tcdC基因存在18个碱基的缺失，导致毒力增强和毒素的增加，产生的毒素A和毒素B分别是传统毒株的16倍和23倍，特别该毒素Ⅲ型的出现及暴发性流行，导致该病的严重病例数、复发率和病死率均明显增高，耐药菌株也在增多。在荷兰分离出艰难梭菌菌株078/BK/NAP7，8（核酸电泳分型为078，限制性内切酶分型为BK，脉冲场凝胶电泳分型为NAP7，8），该菌株也产生毒素A、毒素B和CDT，该型tcdC基因有39bp缺失，并含第184位点突变，导致终止密码子提前产生。有证据表明，近年来艰难梭菌078型感染率逐年递增，人类和动物之间艰难梭菌078型基因序列高度一致，这意味着人和动物之间艰难梭菌078可能不存在种族壁垒，更有利于艰难梭菌078型的传播。此外，除了艰难梭菌023、045、130、122、267型等菌株含有CDT，CDT还广泛存在于产气荚膜梭菌E、螺旋形梭状芽胞杆菌、肉毒梭菌等梭菌中。

2000年至2003年，027/B1/NAP1型艰难梭菌在美国7个州8所医院暴发性流行。2009年艰难梭菌027型已在全美国流行，在芝加哥分离率为61%。2008年抽取欧洲34个国家106所医院进行CDI流行病学调查研究后发现，虽然欧洲各国CDI流行情况不一致，但总体呈增加趋势是比较肯定的（0.0~36.3，平均4.1/10000病人日）。日本、韩国、台湾、科威特等国家和地区的研究也支持CDI增加的结论。虽然各地报道的CDI发病率不一致，总的来说，加拿大医院感染监测中心估计，世界范围内的成人CDI发病率呈增加趋势（4.6/1000个入院患者，或者65/100000病人日）。随着CDI暴发频率增多、发病率增高、危害性变强，国民经济负担也随之加重。据Ghantoji等（Ghantoji SS， Sail K， Lairson DR et al. Economic healthcare costs of Clostridium difficile infection: a systematic review. J Hosp Infect 2010; 74:309–318.）的系统回顾分析，2010年美国用于控制CDI的费用是43.3千万-79.7千万/年。相继在欧洲和北美多次暴发和流行，中国艰难梭菌产毒株分离率达66.7%，近年在香港和广州有027型艰难梭菌的报道