[发明专利]一种从禾本科作物感病组织上直接提取病原菌DNA的方法

权利要求书

1.一种从禾本科作物感病组织上直接提取病原菌DNA的方法，该方法包括：

(1)、提前分别配制以下四种试剂，灭菌后备用：(1)100mM TrisHCl(pH8.7)、(2)10mM EDTA(pH 8.0)、(3)1M KCl和(4)10％Tween 20；

(2)、采集待检测的禾本科作物感染病害的叶片或其它组织作为样品，从发病的禾本科作物的叶片病斑上切取约2mm×2mm大小的叶片放置于PCR-96孔板中；

(3)、根据样品的数量，将步骤(1)中的100mM TrisHCl(pH8.7)、10mM EDTA(pH8.0)和1M KCl各取适量等体积混合后，然后再根据3种混合液的总体积按1000:1的量加入10％的Tween 20；最后混合均匀后,在预先放入样品的PCR-96孔板中每孔各加入100μL提取液；

(4)、将步骤(3)处理好的样品放入PCR仪，95℃加热处理10min，取出样品放置于-20℃备用，或将样品放入湿热灭菌锅，在105℃下处理10min，取出样品放置于-20℃备用。

2.根据权利要求1的方法，其中，PCR-96孔板可以被塑料试管或玻璃试管所代替。

3.一种从禾本科作物感病组织上直接提取病原菌DNA的方法，该方法由以下步骤组成：

1)、提前分别配制以下四种试剂，灭菌后备用：(1)、100mM TrisHCl(pH8.7)、(2)、10mM EDTA(pH 8.0)、(3)、1M KCl和(4)、10％Tween 20；

2)、采集待检测的禾本科作物感染病害的叶片或其它组织作为样品，从发病的禾本科作物的叶片病斑上切取约2mm×2mm大小的叶片放置于PCR-96孔板中；

3)、根据样品的数量，将步骤(1)中的100mM TrisHCl(pH8.7)、10mM EDTA(pH 8.0)和1M KCl各取适量等体积混合后，然后再根据3种混合液的总体积按1000:1的量加入10％的Tween 20；最后混合均匀后,在预先放入样品的PCR-96孔板中每孔各加入100μL提取液；

4)、将上述处理好的样品放入PCR仪，95℃加热处理10min，取出样品放置于-20℃备用，或将样品放入湿热灭菌锅，在105℃下处理10min，取出样品放置于-20℃备用。

4.根据权利要求1或3所述的方法，当所述的禾本科作物为真菌或细菌引起的病害的时候，检测的方法如下，真菌病害：将提取感染病害的样品的DNA用检测真菌rDNA的ITS区段的1对通用引物进行PCR检测，扩增片段大小约500bps,正向引物和反向引物名称和序列分别为，ITS1：TCC GTA GGT GAA CCT GCG G，ITS4:TCC TCC GCT TAT TGATAT GC；当禾本科为水稻叶片的稻瘟病菌DNA检测时，用检测稻瘟病菌无毒基因AvrPizt的特异引物进行，扩增片段大小为1186bps,正向引物和反向引物名称及序列分别为，AvrPizt-1Fw:AAG CGT CAC AAA ATA TCA TCA AGT，AvrPizt-1Rv:CGG CTA CCA TCGAGA AAA GT；当禾本科为水稻叶片的细菌病害：将提取感染病害的样品的DNA用检测细菌16S rDNA的1对通用引物进行PCR扩增，扩增片段大小约1.5kb，正向引物和反向引物分别及序列为，27F:AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG、1942R:ACG GCT ACCTTG TTA CGA CTT；PCR反应体系20μL，包含：2×Taq MasterMix 10μL，正向引物及反向引物各1μL(引物浓度10μM)，制备好的DNA模板1μL，无菌双蒸水6μL；PCR扩增条件为：95℃预变性3min,然后进入35个循环的扩增反应，即95℃变性30min，55℃退火30min，72℃延伸1.5min，循环结束后再延伸7min，然后将PCR产物放置于4℃。

5.根据权利要求1-4之一所述的方法，其中禾本科植物病害为水稻的稻瘟病，玉米的叶片上的玉米灰斑病或者水稻叶片上的水稻细菌性条斑病。

6.根据权利要求1-4之一所述的方法，其中禾本科作物组织样品为水稻叶片和穂颈上的稻瘟病病斑；玉米的叶片上玉米灰斑病病斑或者水稻叶片上水稻细菌性条斑病斑。

7.根据权利要求6所述的方法，当禾本科作物组织样品为水稻穂颈上的稻瘟病病斑时，从水稻穂颈上取1-2mm长的发病穂颈放置于所述的PCR-96孔板中。