[发明专利]一种从禾本科作物感病组织上直接提取病原菌DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物分子检测领域，特别的，属于一种从禾本科作物感病组织上直接提取病原菌DNA的方法。

背景技术

作物病原微生物DNA的提取是开展相关病原分子检测与分析的基础。传统病原真菌DNA的提取常采用的方法是CTAB提取法和细胞壁裂解法等。CTAB法需要前期液氮的研磨，或者使用酶进行细胞破壁，然后要使用氯仿等有毒试剂抽提以去除蛋白，进行DNA沉淀和洗脱等多个步骤，虽然能获得质量高的DNA,但整个过程耗时长，效率低。而且，DNA分离的前期需要完成病原微生物的分离与培养，实验周期长。采用试剂盒提取的方法，虽然比传统的方法简便了许多，但又存在成本高的问题，不利于大量样品的分析与检测。近年来，随着分子生物学技术的飞速发展，建立在真菌rDNA的ITS区段PCR扩增序列比较分析的真菌病害诊断鉴定技术、建立在细菌16S rDNA区段PCR扩增序列比较分析的细菌病害诊断鉴定技术已成熟；诸多的无毒基因不断从病原菌中被成功分离克隆以及大量可用的分子标记信息，为采用建立在PCR基础上的病原微生物快速诊断、病原菌群体的遗传多样性分析以及病原菌无毒基因的快速检测与监测等奠定了坚实的基础。建立一种快速分离病原微生物的DNA技术，特别是能直接从发病组织直接分离病原菌的DNA技术，用于建立在PCR技术上的分子诊断与检测，将极大地提高工作效率。

发明内容

采用一步法，直接从水稻稻瘟病叶瘟和穂颈瘟病斑上直接提取病原菌的DNA的方法，该方法提取的DNA可用于稻瘟病菌群体无毒基因的分子检测与监测，将极大地提高工作效率，省去水稻稻瘟病病原菌的分离、保存、培养等前期数天的准备过程，而且DNA的提取仅需一步即可完成，提取的DNA可直接用作PCR的扩增的模板进行有效扩增，与已有的DNA提取方法相比，可大大缩短DNA提取的时间，减少工作的繁琐性，实现基于PCR技术的田间稻瘟病菌种群无毒基因构成的快速检测与监测。

同时，应用本方法，成功从玉米灰斑病病斑上成功分离玉米灰斑病病原真菌的DNA,从水稻细菌性条斑病病斑上成功分离到病原细菌的DNA,表明该方法不仅能在用于感染稻瘟病的水稻组织病原菌的DNA提取，同时可应用于禾本科其它作物的真菌或细菌病害感病组织的病原菌DNA的提取，为开展其它病害病原菌的分子遗传多样性及新病害的快速分子诊断提供一种DNA提取的重要方法和途径。

一方面，本发明提供一种从禾本科作物感病组织直接提取DNA的方法，该方法包括：1)、提前分别配制以下四种试剂，灭菌后备用：(1)、100mM TrisHCl(pH8.7)、(2)、10mM EDTA(pH 8.0)、(3)、1M KCl和(4)、10％Tween 20；

2)、采集待检测的感染病害的禾本科作物的叶片或其它组织作为样品，从发病的禾本科的叶片病斑上切取约2mm×2mm大小的叶片或从水稻穂颈上取1-2mm长的发病穂颈分别放置于PCR-96孔板中；

3)、根据样品的数量，将步骤(1)中的100mM TrisHCl(pH8.7)、10mM EDTA(pH8.0)和1M KCl各取适量等体积混合后，然后再根据3种混合液的总体积按1000:1的量加入10％的Tween 20；最后混合均匀后,在预先放入样品的PCR-96孔板中每孔各加入100μL提取液；

4)、将上述处理好的样品放入PCR仪，95℃加热处理10min，或将样品放入湿热灭菌锅，在105℃下处理10min，取出样品放置于-20℃备用。

在一些优选的方式中，PCR-96孔板可以被任何容器所代替，只要这种容器可以被加热进行步骤4的处理就可以了。

在一些优选的方式中，单个病斑的大小可是任意合适的面积，例如2mm×2mm；1mm×2mm；0.5mm×2mm或者多个相同面积的病斑。除了叶片或穂颈上的病斑外，其他组织的病斑也可以采用本发明的方法进行。

在另外一方面，本发明提供一种从感病禾本科作物组织上直接提取病原菌DNA的方法，该方法由以下步骤组成：

1)、配制以下四种试剂，灭菌后备用：(1)、100mM TrisHCl(pH8.7)、(2)、10mM EDTA(pH 8.0)、(3)、1M KCl和(4)、10％Tween 20；

2)、采集待检测的感染病害的组织，从发病的禾本科作物叶片上切取2mm×2mm大小的发病叶片分别放置于PCR-96孔板中；