[发明专利]一种体外酶反应生成异戊二烯的方法及应用

权利要求书

1.一种体外酶反应生成异戊二烯的方法，其特征在于，将表达甲羟戊酸激酶基因，磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和异戊二烯合成酶基因分别导入宿主菌，发酵培养所得的五种重组菌，再利用超声波分别破碎菌体获得粗酶液，混合五种粗酶液获得反应酶液，再向反应酶液中加入反应底物溶液后体外合成异戊二烯。

2.权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下：

1)将获得的甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、戊烯焦磷酸异构酶基因IDII和异戊二烯合成酶基因Isps4分别构建入宿主菌表达质粒载体中，获得五种重组质粒；

2)将步骤1)所得的五种重组质粒分别导入宿主菌，获得五种重组菌；

3)发酵培养步骤2)所得五种重组菌，分别表达甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、戊烯焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶；

4)收集步骤3)所培养的菌体，分别超声破碎后，获得五种粗酶液；

5)按比例混合步骤4)所得的五种粗酶液，获得反应酶液；

6)向步骤5)所得的反应酶液中加入反应底物溶液，混合均匀后获得混合反应液；

7)将步骤6)所得的混合反应液，转移至厌氧反应瓶中，补水后密封，在室温下静置反应120min，获得异戊二烯溶液。

3.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII，来源于粪肠球菌、酿酒酵母、金黄色葡萄球菌或肺炎双球菌；所述异戊二烯合成酶基因Isps4，来源于葛根或柏杨。

4.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，GeneBank登录号为855248；所述磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，GeneBank登录号为855260；所述甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19，GeneBank登录号为100195467；所述异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII，GeneBank登录号为855986；所述异戊二烯合成酶Isps4，GeneBank登录号为AB198180。

5.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述宿主菌为大肠杆菌、酿酒酵母或枯草芽孢杆菌。

6.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述超声破碎，超声频率为22kHz,超声功率为150W，超声时间为10min。

7.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述混合五种粗酶液，是调整甲羟戊酸激酶的浓度至60-160μg/L；磷酸甲羟戊酸激酶60-160μg/L；甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶60-160μg/L；异戊烯焦磷酸异构酶60-160μg/L；异戊二烯合成酶60-160μg/L。

8.权利要求7所述方法，其特征在于，所述混合五种粗酶液，是调整甲羟戊酸激酶的浓度至160μg/L，磷酸甲羟戊酸激酶80μg/L；甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶80μg/L；异戊烯焦磷酸异构酶60μg/L；异戊二烯合成酶160μg/L。

9.权利要求1和2所述方法，其特征在于，所述反应底物溶液，与粗酶液混合后最终浓度为50mM磷酸盐缓冲溶液，4mM ATP，30mM KCl，8mM MgCl₂，0.2mM MnCl₂，0.01mM ZnSO₄，4mMβ-巯基乙醇和2.5mM甲羟戊酸。

10.权利要求1-9所述方法，其特征在于，用于利用甲羟戊酸为底物或中间产物，体外酶反应生产异戊二烯以及异戊二烯基单元合成的萜类化合物。