[发明专利]一种体外酶反应生成异戊二烯的方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种体外酶反应生成异戊二烯的方法及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

异戊二烯是一种重要的化工平台化合物，其95％用于合成橡胶；也是丁基橡胶的第二单体。此外，异戊二烯还广泛应用于农药、医药、香料及粘结剂等领域。目前，异戊二烯的来源主要是通过石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括异丁烯-甲醛法、乙炔-丙酮法、丙烯二聚法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法。然而，随着化石资源的日益枯竭，原料来源是利用石油基原料制备异戊二烯的重要瓶颈问题。

随着分子生物学的发展，研究者开始探讨生物法合成异戊二烯可行性。生物体中主要存在两种天然的代谢途径进行异戊二烯的生物合成，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径。Yang jianming等在大肠杆菌内过表外源MEP途径，通过发酵罐发酵48h后，异戊二烯产量达到300mg/L，产率仅为1.8％。Genencor公司以大肠杆菌为宿主菌，表达外源MVA途径相关酶及葛根异戊二烯合成酶，通过发酵优化使异戊二烯产量达到100g/L左右，但是其发酵时间长达88h，时间产率仅为1.33g/L/h，由于发酵过程中碳代谢流不能精确控制，其质量产率仅为8.3％。虽然通过MVA代谢途径制备异戊二烯及其相关的萜类化合物有了一定的进展，但是由于缺少相对稳定状态的动力学信息和合成途径中代谢通量的详尽了解，只是在细胞内通过相关酶的突变、改变酶的表达强度调节酶的含量以及调节各种酶的组合等复合方法来调控目标产物的产量(Gibson,Methods Enzymol,498:349–361,2011；Shao and Zhao,Nucleic Acids Res 37(2):e16,2009；Parayil Kumaran Ajikumar et al.，Science,330(6000):70–74,2010)。这些方法具有很强的随机性，并不能够精确控制各种酶的组合及用量。通过非细胞的体外反应，可以在体外指导最佳的反应体系，通过精确的控制各酶的含量及添加相关的辅助因子用量，找出整个代谢途径中的关键因素，寻找关键步骤，确定关键酶。为细胞内代谢途径优化提供参考依据。刘天罡等在用九个纯化蛋白在体外构建了MVA代谢途径生产法呢烯，根据体外反应信息指导优化细胞内法呢烯的生产，使法呢烯产量提高了2000倍(Tiangang Liu et al.,Biotechnol.Bioeng,9999:1–10,2014)。目前，尚未有报道以甲羟戊酸为底物，利用五个粗蛋白体外构建异戊二烯合成代谢途径的相关报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种体外酶反应生成异戊二烯的方法，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种体外酶反应生成异戊二烯的方法，该方法是将表达甲羟戊酸激酶基因，磷酸甲羟戊酸激酶基因、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因和异戊二烯合成酶基因分别导入宿主菌，发酵培养所得的五种重组菌，再利用超声波分别破碎菌体获得粗酶液，混合五种粗酶液获得反应酶液，再向反应酶液中加入反应底物溶液后体外合成异戊二烯

所述方法的步骤如下：

1)将获得的甲羟戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19、戊烯焦磷酸异构酶基因IDII和异戊二烯合成酶基因Isps4分别构建入宿主菌表达质粒载体中，获得五种重组质粒；

2)将步骤1)所得的五种重组质粒分别导入宿主菌，获得五种重组菌；

3)发酵培养步骤2)所得五种重组菌，分别表达甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、戊烯焦磷酸异构酶和异戊二烯合成酶；

4)收集步骤3)所培养的菌体，分别超声破碎后，获得五种粗酶液；

5)按比例混合步骤4)所得的五种粗酶液，获得反应酶液；

6)向步骤5)所得的反应酶液中加入反应底物溶液，混合反应液；

7)将步骤6)所得的混合反应液，转移至厌氧反应瓶中，补水后密封，在室温下静置反应120min，获得异戊二烯溶液。

所述基因来源为化学合成、扩增自微生物或扩增自重组质粒。

优选地，所述甲羟戊酸激酶基因ERG12，磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8，甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶基因ERG19和异戊烯焦磷酸异构酶基因IDII，来源于粪肠球菌、酿酒酵母、金黄色葡萄球菌或肺炎双球菌；所述异戊二烯合成酶基因Isps4，来源于葛根或柏杨。