[发明专利]白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因的快速检测方法，尤其涉及一种白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的引物和试剂盒。

背景技术

WT1基因的表达及表达量与急性白血病的发生、发展及预后有密切关系，在微小残留病检测方面具有重要意义。WT1基因在正常组织中仅在胎儿肾脏、睾丸、卵巢及早期造血组织中高度表达，在未成熟的淋巴系及髓系白血病细胞中高表达，可以作为急性白血病细胞的标志物。

WT1基因是影响白血病患者CR率的最重要危险因素之一，与白血病患者的化疗效果及预后密切相关，WT1基因表达阳性者，CR率低、易复发、预后差。WT1基因在白血病患者中的表达有规律可循，治疗前高表达，治疗缓解后转阴性，复发前再转为阳性表达，长期生存者多为阴性。因此，检测WT1的表达可作为化疗和骨髓移植后微小残留病(MRD)检测的敏感指标，也是研究白血病发生、发展和预测预后的手段。

目前检查WT1基因主要通过PCR或实时荧光定量PCR。PCR耗时长、一般需要4-5个小时，灵敏度和特异性低、仪器要求高，而且PCR结束之后需要通过电泳判断结果，电泳所用DNA染料EB有剧毒。实时荧光定量PCR方法虽然特异性和灵敏度有所提高，但是需要产生荧光的引物和探针，还需要昂贵的检测设备，而且需要2-3个小时的检测时间；因此现有的检测方法存在白血病微小残留病检测中易出现假阳性、检测成本高、操作复杂、检测时间长的问题。

环介导等温扩增方法已经广泛应用于微生物检测领域，并有很多相关专利获得授权，但在肿瘤及白血病研究领域未见应用。目前国内外均未见使用LAMP方法检测白血病WT1基因的报道。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的引物和试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的引物，F3:其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；B3：其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；FIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，BIP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；LP：其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

上述引物在检测急性白血病微小残留病中的应用。

一种白血病微小残留病WT1基因快速检测方法的试剂盒，内含LAMP反应液、阳性对照、阴性对照，所述LAMP反应液的成分为：0.04μmol/μL pH为8.8的Tris-HCl，0.02μmol/μL KCl，0.016μmol/μL MgSO₄，0.02μmol/μL(HN₄)₂SO₄，0.002μl/μL Tween₂₀，1.6μmol/μL甜菜碱，0.0028μmol/μL×4种dNTPs，10U/μL逆转录酶，8U/μL Bst DNA聚合酶，0.00005μmol/μL钙黄绿素，0.2pmol/μL F3，0.2pmol/μL B3，1.6pmol/μL FIP，1.6pmol/μL BIP，0.8pmol/μL LP；

阳性对照为：反应时在反应液中加入WT1RNA表达阳性的NB4细胞的基因组RNA；

阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水。

上述试剂盒中LAMP反应液为1mL、阳性对照50μL、阴性对照1mL。

上述试剂盒还包括：反应管50个，1-10μL移液器头100个。

上述试剂盒的使用方法：取20μL反应液置于反应管中，将5μL待检RNA加入反应液内，用移液器吹打混匀，盖好反应管的盖子，将反应管置于水浴锅中进行扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应25-30min；用户在初次使用时需要设置阴性对照和阳性对照。

本发明的有益效果：

本发明提供了用环介导等温扩增方法检测WT1基因的引物，建立了白血病微小残留病WT1基因检测新方法。采用本试剂盒检测WT1基因，结合RNA快速提取试剂，从取得样本到结果判定结束可以控制在1h内。

本试剂盒采用环介导等温扩增技术检测WT1基因的表达，一步法反应，不需要将RNA预先逆转录为cDNA，基因扩增和结果判定在一个管中，不需要跑电泳，可以有效避免因形成气溶胶而导致的DNA污染及假阳性的产生，仪器设备只需要恒温水浴锅，检测时间不超过0.5小时，而且因为扩增效率极高，痕量RNA即可被扩增检测到，所以对标本质量及数量要求不高。