[发明专利]一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物检测领域，涉及一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法。

背景技术

微生物胞外呼吸是指在厌氧条件下微生物在胞内氧化有机物释放电子，并且偶联呼吸链将产生的电子传递到胞外受体使其还原的过程。能够接受其电子而被还原的胞外受体种类繁多，包括水溶性的铀，金和银离子，硫酸盐，铁锰矿物和腐殖质等。此外，人造电极也能够接受胞外呼吸过程传递到胞外的电子，从而产生电流。因此，微生物胞外呼吸具有重要的应用价值，在污染物原位修复、污水处理、微生物冶炼、微生物合成及微生物产电等方面表现出重要的应用前景。鉴于胞外呼吸广泛的应用前景，开发低成本快速检测微生物胞外呼吸活性的方法具有重要意义。目前，针对微生物胞外呼吸活性的检测方法，有异化铁还原法，腐殖质还原法和生物电流法。然而，这些方法操作程序复杂而且耗用时间长。

微生物自身携带的酶催化显色反应是进行微生物活性检测的有效方法。在胞外呼吸过程中，微生物氧化有机物产生的电子必须通过复杂电子传递网络传递到达细胞外膜，然后通过外膜上的多血红素细胞色素c传递到胞外。已有研究表明，胞外呼吸菌80％的膜结合的c型细胞色素位于细胞外膜，而且这些c型细胞色素与辣根过氧化物酶具有铁卟啉结构，因此具有相似的过氧化氢酶活性。对现有的技术检索发现，目前还没针对微生物胞外酶开发的检测胞外呼吸活性的方法。因此，利用胞外呼吸菌外膜细胞色素c的过氧化氢酶活性，结合微孔板快速检测技术，可以开发出一种新型微生物胞外呼吸活性快速检测方法。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明通过研究将微生物外膜细胞色素c过氧化氢酶活性的信号放大作用与微孔板快速检测系统相结合，构建了一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法。该方法具有可靠性高，操作简单，检测迅速。

本发明的目的在于提供一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种快速检测微生物胞外呼吸活性的方法，包括以下操作步骤：

1）将待测的微生物菌悬液中加入显色液进行显色反应；

所述显色液含有柠檬酸钠、磷酸氢二钠、四甲基联苯胺和过氧化氢，pH为4～5；

2）往上一步的反应液中加入终止液以终止显色反应，然后检测反应液在450nm处的OD值；

3）结果分析：OD_450nm值越大说明待测微生物胞外呼吸活性越强。

进一步的，上述微生物菌悬液中微生物浓度不小于2×10⁸ cfu/ml。

进一步的，上述微生物菌悬液中的液体为生理盐水或HEPES缓冲液。

进一步的，上述显色液的体积为微生物菌悬液的0.8～1.2倍。

进一步的，上述显色液含有80～120mM柠檬酸钠，180～220mM磷酸氢二钠，0.3～0.35mM四甲基联苯胺和1.8～2.2mM过氧化氢，pH为4～5。 

进一步的，上述显色液含有100mM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0.32mM四甲基联苯胺和2mM过氧化氢，pH为4.3。

进一步的，上述显色反应时间为15～25min，温度为18～27℃。

进一步的，上述终止液的体积为显色液体积的0.4～0.6倍。

进一步的，上述终止液为硫酸溶液。

进一步的，上述终止液为1.8～2.2M硫酸溶液。

本发明的有益效果是：

（1）细胞色素c是胞外呼吸菌的关键酶，具有较强的过氧化氢酶活性，能够快速催化过氧化氢快速氧化四甲基联苯胺产生蓝色产物，最快3分钟即可获得检测结果；

（2）本发明方法可采用微孔板检测，能够实现对多个样品同时进行微量、批量、快速地检测；

（3）本发明所述的微生物胞外呼吸活性的检测方法可靠性高，其检测结果与传统的异化铁还原法和生物电流法结果一致。

附图说明

图1为快速检测微生物胞外呼吸活性的示意图；

图2为各微生物中胞外细胞色素c的漫反射光谱图及含量，A为漫反射光谱图，B为胞外细胞色素c的含量；

图3为异化铁还原法和生物电流法检测各微生物胞外呼吸活性结果图；A和B为异化铁还原法检测各微生物胞外呼吸活性结果，C为生物电流法检测的结果；

图4为实施例2检测各微生物胞外呼吸活性的结果；

图5为快速检测法与传统方法的相关分析；

图6为快速检测方法的特异性结果。

具体实施方式