[发明专利]一种转化芽孢杆菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种转化芽孢杆菌的方法。

背景技术

数千年前，人类已经开始采用发酵来制作酒、泡菜、酸奶等食品。但是随着现代微生物学的发展，我们可以通过发酵生产更多的产品，包括：1、菌体，益生菌、酵母粉等，2、初级代谢产物，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、乙醇、柠檬酸、丙酮、谷氨酸、赖氨酸、核苷酸、维生素等，3、次级代谢产物，如青霉素、卡那霉素、四环素、抗菌肽等物质，4、产品转化，如将牛奶转化为酸奶，淀粉转化为乙醇等。这些产品都极大地改善了我们的生活。

发酵技术除了需要特定的发酵工生产艺外，发酵技术的关键点在于拥有独特的菌株。在现代微生物学的促进下，可以通过菌株筛选和诱变，得到拥有独特性质的菌株。但是该过程周期较长，并且具有不确定性。随着分子生物学的兴起，通过基因工程改造菌株，可以快速高效地获得拥有独特性质的菌株，基因工程的改造技术的前提技术之一就是细菌转化技术，只有将需要改造的目的片段导入到目标菌株之后才能对目标菌株进行改造。

芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，不含有内毒素。芽孢杆菌属下的枯草芽孢杆菌种还被FDA认为具有生物安全性的菌株。目前芽孢杆菌可用于生产蛋白酶、淀粉酶等产品，也可作为益生菌添加到食品中。因此建立芽孢杆菌的转化方法和基因改造方法具有重要的科研和经济价值。

芽孢杆菌的转化方法可以分为化学转化法、原生质体转化法和电转化法。化学转化法是由Spizizen在上世纪五十年代末建立的，该方法利用芽孢杆菌从丰富培养基转移到低营养培养基上生长后，在一段时间内呈现可被转化状态的原理，复合钙离子和镁离子刺激的方法，可将DNA片段或者质粒转入细菌中。但是该转化方法转化效率较低，只能用于枯草芽孢杆菌模式菌株168等特定菌株。原生质体法是通过溶菌酶降解细菌细胞壁产生原生质体，在采用PEG等物质刺激就可以将细胞外的DNA转入细胞内。但是该方法操作繁琐，条件不容易控制，转化效率不高，已经很少采用。电转化法是上世纪八十年代末开始建立的方法，将生长到一定阶段的芽孢杆菌放入特定的电转化液中，施加强电场，击穿细胞壁，让转化液中的DNA进入细胞。到目前为止，文献报道的用于芽孢杆菌的电转化方法不下于数十种。最近几年仍然有人在改进芽孢杆菌的转化方法，xue等人在1999年建立了一种利用甘露醇和山梨醇配制高渗的转化液，可显著提高转化效率（High osmolarity improves the electro-transformation efficiency of the gram-positive bacteria Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis, Journal of Microbiological Methods, 1999, 34:183–191）。2006年，Romero等人发表了一种电转化原生质体的转化方法，可以转化一些不易转化的野生型菌株（Transformation of undomesticated strains of Bacillus subtilis by protoplast electroporation, Journal of Microbiological Methods, 2006, 66:556–559）。Cao等人在高渗转化法的基础上，添加了海藻糖，可提高转化效率（A modified electro-transformation method for Bacillus subtilis and its application in the production of antimicrobial lipopeptides, Biotechnol Lett (2011) 33:1047–1051）。Fatma等人在高渗转化法的基础上，添加甜菜碱，可显著提高电击后细菌的存活率，提高转化效率。但是电转化法的菌株特异性较高，一种转化方法只能转化一些菌株。

在实际基因工程改造中，只能对菌株进行少量的改造，因此需要选择特性相对较好的野生型菌株进行改造。但是上述的转化方法局限性很大，只能转化少数野生型菌株。因此建立一种适应性较广的芽孢杆菌转化方法，可解决野生芽孢杆菌不能被转化的问题。

发明内容