[发明专利]抗黑色素瘤DNA质粒疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，包括质粒载体，其特征在于所述质粒载体中含有黑色素瘤特异肿瘤抗原（Trp₂）、细胞因子（GM-CSF）、Fc融合蛋白3种基因表达单位元件和绿荧光蛋白报告基因的重组质粒，用PCR扩增 Trp₂、GM-CSF、Fc目的基因片段，分别通过双切酶连接到真核表达的质粒载体上，构建成pEGFP-Trp₂-GM-CSF-Fc质粒。

2.如权利要求1所述的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，其特征在于所述质粒载体中含有Trp₂（NCBI Reference Sequence: NM_006115.3）对应的全部基因序列。

3.如权利要求1所述的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，其特征在于所述质粒载体中含有GM-CSF（GenBank: M11220.1）对应的全部基因序列。

4.如权利要求1所述的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，其特征在于所述质粒载体中含有Fc融合蛋白（GenBank: X67292.1）对应的全部基因序列。

5.如权利要求l所述的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，其特征在于所述质粒载体为pUCM-T Vector。

6.一种权利要求1所述的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗的制备方法，其特征在于包括下述步骤:

l）分别根据GenBank的Trp_2、GM-CSF、Fc的功能编码区的序列，采用相关计算机软件进行引物设计, 人外周白细胞或淋巴细胞总RNA提取及cDNA合成，以反转录出的各自第一条 cDNA 为模板，用PCR扩增 Trp₂、GM-CSF、Fc目的基因片段，切胶回收；

2）目的基因片段（Trp₂、GM-CSF、Fc）分别与T载体（pGEM-T Vector）连接，转化并酶切鉴定筛选；构建的三种目的基因质粒及pEGFP-N2质粒的扩增、抽提，并分别进行双酶切，使得在GM-CSF两端引入Sal I、BamH I酶切位点，在Trp₂两端引入Bgl II、Sal I酶切位点，在Fc两端引入EcoR I、BamH I酶切位点，在EGFP两端引入BamH I、Bgl II酶切位点；

3）目的片段（Trp₂、GM-CSF、Fc、EGFP）与用T4 DNA连接酶pUCM-T Vector载体连接；

4）将连接产物转化化学感受态细胞中，在合适温度下的培养基中培养扩增；经过筛选和质粒抽提试剂盒抽提获得DNA质粒疫苗pEGFP-Trp₂-GM-CSF-Fc。

7.如权利要求6所述的抗黑色素DNA质粒疫苗的制备方法，其特征在于：将所述DNA质粒疫苗溶于磷酸盐缓冲液中，并以阳离子聚合物PEI为免疫佐剂和给药载体，制备得到含有阳离子聚合物的DNA质粒疫苗。