[发明专利]抗黑色素瘤DNA质粒疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA疫苗，具体涉及一种抗黑色素瘤DNA质粒及其制备方法。

技术背景

恶性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是一类起源于神经嵴黑色素细胞的恶性肿瘤，多发于皮肤，是一种最具有侵袭性的皮肤肿瘤，具有发病年龄早，转移率高等特征。目前，我国MM的发病率相对较低，但随着我国工业的发展和环境状况的恶化，其发病率的增长速度已远远超过其他恶性肿瘤，近四年间我国恶性黑色素瘤的发病率升高了5倍，是肿瘤发病率增长最快的一种。由于MM的恶性程度高，发生比较隐匿，且对目前临床各种治疗方法极不敏感，尤其是对化疗药具有较高的耐受性。因此，应用免疫疗法治疗恶性黑色素瘤被认为是极具前景的治疗策略。

DNA疫苗是在基因治疗和转基因技术基础上产生的第三代疫苗，是疫苗的一次革命，在预防和治疗病毒、细菌等传染病和肿瘤等方面具有广阔的应用前景，DNA疫苗进入体内后主要依靠树突状细胞（DCs）的递呈，产生免疫应答。不成熟的DCs会导致肿瘤的特异性耐受和免疫逃逸，而成熟的DCs可产生免疫反应，也就是说处于不同成熟阶段的DCs决定了机体发生免疫反应的类型。可见，改变DC的表型和功能将是机体对肿瘤抗原产生免疫应答的前提。

作为肿瘤免疫治疗的DNA疫苗是将编码某种肿瘤特异性抗原蛋白的外源基因（DNA或RNA）直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达、合成抗原蛋白，进而活化能特异性杀伤肿瘤细胞的T细胞，以达到预防和治疗肿瘤的目的。树突状细胞是机体内抗原呈递功能最强、唯一能在体内激活初始型T细胞的抗原呈递细胞，同时可以通过MHCⅠ和MHCⅡ 类分子途径呈递抗原，并提供充分的共刺激信号，在T细胞抗肿瘤免疫应答的启动、调控过程中起着关键作用。而细胞因子能刺激DCs的成熟和递呈，特别是GM-CSF（粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）是一种强烈刺激巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞的增殖、分化、活化、成熟和趋化的细胞因子。但现有的DNA疫苗的抗原性不强，并不能有效防治黑色素瘤，为此需要寻找一种有效的DNA疫苗。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有DNA疫苗的抗原性不强，并提供一种制备简单、成本低廉且安全可靠有效防治黑色素瘤的抗黑色素瘤DNA质粒疫苗。

本发明还相应地提供一种抗黑色素瘤DNA质粒疫苗的制备方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种抗黑色素瘤DNA质粒疫苗，包括质粒载体，其特征在于所述质粒载体中除了黑色素瘤特异肿瘤抗原（Trp₂）目的基因，增加了强烈刺激巨噬细胞和树突状细胞等抗原呈递细胞的增殖、分化、活化、成熟和趋化的细胞因子（GM-CSF）以及Fc融合蛋白2种基因表达单位元件和报告基因的重组质粒的真核表达载体。

所述抗黑色素瘤DNA质粒疫苗含有Trp₂对应的全部基因序列。

所述质粒载体中含有GM-CSF对应的全部基因序列。

所述质粒载体中含有Fc融合蛋白对应的全部基因序列。

所述质粒载体pUCM-T，也可用其他的真核表达质粒载体pcDNA3.0、pcDNA3.1等。

还提供一种制备上述抗黑色素瘤DNA质粒疫苗的制备方法，其特征在于包括下述步骤:

l）分别根据GenBank的Trp_2、GM-CSF、Fc的功能编码区的序列，采用相关计算机软件进行引物设计, 人外周白细胞或淋巴细胞总RNA提取及cDNA合成，以反转录出的各自第一条 cDNA 为模板，用PCR扩增 Trp₂、GM-CSF、Fc目的基因片段，切胶回收；

2）目的基因片段（Trp₂、GM-CSF、Fc）分别与T载体（pGEM-T Vector）连接，转化并酶切鉴定筛选；构建的三种目的基因质粒及pEGFP-N2质粒的扩增、抽提，并分别进行双酶切，使得在GM-CSF两端引入Sal I、BamH I酶切位点，在Trp₂两端引入Bgl II、Sal I酶切位点，在Fc两端引入EcoR I、BamH I酶切位点，在EGFP两端引入BamH I、Bgl II酶切位点；

3）目的片段（Trp₂、GM-CSF、Fc、EGFP）与用T4 DNA连接酶pUCM-T Vector载体连接；

4）将连接产物转化化学感受态细胞中，在合适温度下的培养基中培养扩增；经过筛选和质粒抽提试剂盒抽提获得DNA质粒疫苗pEGFP-Trp₂-GM-CSF-Fc。