[发明专利]一种重组葡萄糖‑果糖氧化还原酶及其真菌表达载体和真菌杀虫剂

权利要求书

1.一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶，其特征在于，为一融合蛋白，所述融合蛋白由来源于球孢白僵菌几丁质酶的分泌型信号肽与来源于运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的成熟蛋白区域融合而成；采用分子生物学技术构建本发明重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的核苷酸序列，其由编码球孢白僵菌几丁质酶的信号肽序列与编码运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶的成熟蛋白区域序列组成，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。

2.一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的构建方法，包括如下步骤：

1）葡萄糖-果糖氧化还原酶序列GFOR、信号肽BbSP及启动子PgpdA的扩增：

设计引物PGFOR-F与PGFOR-R，扩增基因bank登录号M97379的GFOR序列的成熟蛋白区域，模板为运动发酵单胞菌的基因组；设计引物PBbsp-F与PBbsp-R，扩增基因bank登录号AY145440的BbSP的信号肽序列，模板为球孢白僵菌基因组；设计引物PgpdA-F与 PgpdA-R，扩增基因bank登录号AY679162的球孢白僵菌磷酸甘油醛脱氢酶PgpdA的组成性启动子，模板为球孢白僵菌基因组；引物序列如下：

PGFOR-F：5’- CCCTTGGCGCCGCGAGCCGGCGCGACGCTTCCTGCTGGTGCCAG-3’

PGFOR-R：5’-CTCGAGTTAACCCAAATAGGTTAAGTC-3’

PBbsp-F：5’-ATGGCTCCTTTTCTTCAA AC-3’

PBbsp-R：5’- GCCGGCTCGCGGCGCCAAGGG-3’

PgpdA-F：5’-GTTGGGTATGCTCCGGC-3’

PgpdA-R：5’-GTTTGAAGAAAAGGAGCCATGGTTGTTATTGATTAAAAGG -3’

PCR反应的混合物为：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液，2 μL 2.5 mM的 dNTP， 10µM的上下游引物各1 µL，30 ng的基因组模板，0.4 U 的phusion Taq DNA 聚合酶，加超纯水至总体积为25 μL；

PCR反应条件为：98^oC预变性2 min； 98^oC变性20 s，56^oC退火30 sec，72℃延伸1 min，32个循环；最后 72^oC 延伸5 min；

PCR反应产物经质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳后，分别用胶回收试剂盒回收GFOR、Bbsp和PgpdA；

2）融合基因的构建：

因为PgpdA的羧基端与BbSP的N端，BbSP的羧基端与GFOR的N端分别有20bp的相同序列，所以可利用无引物PCR组装的方法将三个片段组装在一起；

其中，PCR反应的混合物为：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液, 2 μL 2.5 mM dNTP，回收的GFOR、BbSP、PgpdA各30 ng，0.4 U 的phusion Taq DNA 聚合酶，加超纯水至总体积 25 μL；

PCR反应条件为：98^oC预变性2 min; 98^oC变性20 s, 56^oC退火30 sec, 72℃延伸1min，20个循环；最后72^oC 延伸5 min；

取上述PCR反应组装产物1 μL做模板，用引物PgpdA-F与PGFOR-R扩增PgpdA_-BbSP-GFOR，PCR反应混合物：5 μL 5×Phusion Taq 聚合酶缓冲液，2 μL 2.5 mM dNTP，10 µM的PgpdA-F与PGFOR-R引物各1µL，1 μL组装产物，0.4 U 的Phusion Taq DNA 聚合酶，加超纯水至总体积 25 μL；

PCR反应条件为：98℃预变性2 min；98℃变性20 s，56℃退火30sec, 72℃延伸2.5min，32个循环；最后72℃ 延伸5 min；

将PCR反应扩增的PgpdA_-BbSP-GFOR经琼脂糖电泳，并用胶回收试剂盒回收后，克隆进pCR-Blunt vector，得pCR-Blunt-PgpdA-BbSP-GFOR；经测序分析后，用限制性内切酶EcoRI酶切pCR-Blunt-PgpdA-BbSP-GFOR质粒，回收PgpdA-BbSP-GFOR片段。