[发明专利]一种重组葡萄糖‑果糖氧化还原酶及其真菌表达载体和真菌杀虫剂

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶及其真菌表达载体和真菌杀虫剂，具体涉及一种含有真菌的分泌型信号肽和细菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶GFOR序列的重组蛋白及其真菌表达载体和真菌杀虫剂。

背景技术

我国是农业生产大国，粮食产量连年丰收，其中农药的使用功不可没。但数据显示，我国平均农药使用量是世界平均水平的2.5倍，农药的过量使用对环境造成了污染，威胁着农产品的质量安全与食品安全。因此，开发高效、对环境安全、专一性强的生物农药，减少常规化学农药的使用，将有利于环境健康及食品安全。

昆虫病原真菌是控制自然界昆虫种群数量的主要因素之一，以其为主要活性成份的生物农药已在我国、欧美及非洲得到广泛应用。但生物农药，包括细菌、病毒及真菌类杀虫剂均存在击倒害虫时间过长和防效不稳定等缺点，因此如何提高这些生物类杀虫剂的效率，并研究其作用机理已成为该领域的一个研究重点。

在真菌侵染宿主的过程中，昆虫会利用自身的防御系统抵御真菌的侵入。昆虫体壁可以为其提供物理屏障，自身的免疫系统则可识别入侵的病原体，将免疫细胞附着在病原体表面，吞噬病原体，形成黑色素。此外，免疫系统还会产生大量的抗菌蛋白，抑制真菌的生长，在此过程中，昆虫的免疫系统可产生革兰氏阴性细菌结合蛋白（Gram-negative bacteria binding proteins GNBPs），检测不应存在的微生物，并引发相关的免疫反应。由此可以看出，及时、准确地识别入侵微生物是昆虫抵御入侵微生物的前体条件。然而，研究者发现， D-δ-葡萄糖酸内酯（GDL）可以封阻GNBPs的活性，从而让真菌可以快速控制昆虫 (Bulmer MS, 2009)。我们设想，如能在真菌侵染宿主过程中产生D-δ-葡萄糖酸内酯，则可能会帮助真菌逃脱宿主免疫系统的识别，加速真菌在宿主体内的繁殖，从而有效提高真菌的杀虫效果。经筛选发现，来自运动发酵单胞菌（Zymonomas mobilis）的葡萄糖-果糖氧化还原酶Glucose-frustose oxidoreductase (GFOR) 能利用葡萄糖和果糖为底物，产生葡萄糖酸内酯和山梨醇（Kanagasundaram V, 1992）。但能否将该基因导入到杀虫真菌，在真菌侵染过程中产生葡萄糖酸内酯，抑制宿主的免疫反应，提高真菌的杀虫效果，目前还没有相关报道。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶，具体来说，是一种含有来源于球孢白僵菌（Beauveria bassiana）几丁质酶的分泌型信号肽和来源于运动发酵单胞菌（Zymonomas mobilis）的葡萄糖-果糖氧化还原酶重组蛋白区域的融合蛋白。

本发明的另一个目的在于提供一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的构建方法。

本发明的又一个目的在于提供一种含有上述基因核苷酸序列的真菌表达载体。

本发明的再一个目的是提供能产生本发明重组蛋白的真菌杀虫剂。

实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种重组葡萄糖-果糖氧化还原酶，含有一融合蛋白，所述融合蛋白由来源于球孢白僵菌（Beauveria bassiana）几丁质酶的分泌型信号肽与来源于运动发酵单胞菌（Zymonomas mobilis）的葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的成熟蛋白区域融合而成；采用分子生物学技术构建本发明重组葡萄糖-果糖氧化还原酶的核苷酸序列，其含有编码球孢白僵菌几丁质酶的信号肽序列与编码运动发酵单胞菌的葡萄糖-果糖氧化还原酶的成熟蛋白区域序列，具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。

所述重组葡萄糖-果糖氧化还原酶基因的构建方法，包括如下步骤：

1）葡萄糖-果糖氧化还原酶序列GFOR、信号肽BbSP及启动子PgpdA的扩增：

设计引物PGFOR-F与PGFOR-R，扩增GFOR序列的成熟蛋白区域（GFOR，基因bank登录号M97379），模板为运动发酵单胞菌的基因组；设计引物PBbsp-F与PBbsp-R，扩增信号肽序列（BbSP，基因bank登录号AY145440），模板为球孢白僵菌基因组；设计引物PgpdA-F与 PgpdA-R，扩增球孢白僵菌的磷酸甘油醛脱氢酶组成性启动子（PgpdA，基因bank登录号AY679162），模板为球孢白僵菌基因组。引物序列如下：

PGFOR-F：5’- CCCTTGGCGCCGCGAGCCGGCGCGACGCTTCCTGCTGGTGCCAG-3’