[发明专利]一种检测邻苯二甲酸二甲酯的方法及试剂盒

权利要求书

1.一种分泌邻苯二甲酸二甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：通过包含如下步骤的方法制备得到：

（1）取用DMP人工抗原免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞悬液混合；

（2）离心弃上清，加入PEG使细胞融合，再加入1640培养基终止PEG的作用；重复该步骤；

（3）离心弃上清，加入HAT培养基，铺至细胞板中进行培养；

（4）融合后第7天观察，标出有融合细胞的孔，记录位置和克隆数，补加HAT培养基；2周后，用HAT培养基全量换液，待细胞长至板底1/10时做检测；

（5）选择效价最高的并且对DMP具有特异性的阳性细胞进行克隆，克隆化结束后，建株得到分泌DMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

2.根据权利要求1所述的分泌邻苯二甲酸二甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：步骤（1）中所述的DMP人工抗原通过包含如下步骤的方法制备得到：

1）半抗原的合成

往10mL甲醇中加入10g 4-硝基邻苯二甲酸，搅拌下加入1mL浓硫酸作催化剂，120℃回流7h；反应结束后，继续升温，蒸出剩余的甲醇；抽滤除去催化剂，得到粗产品；粗产品用氢氧化钠中和，减压蒸馏收集180～185℃/7.3kPa的馏分，得到纯净的4-硝基邻苯二甲酸二甲酯；用甲醇作溶剂，溶解4-硝基邻苯二甲酸二甲酯，按照每3mmol 4-硝基邻苯二甲酸二甲酯加0.05g钯碳的比例加入钯碳，加氢气还原24小时；除去未参加反应的钯碳和甲醇，得到DMAP晶体；

2）人工抗原的合成

将40mg DMAP溶于2mL二氧六环中，搅拌条件下加入2mL 1mol/L HCl；待冷却至4℃，滴加200μL 7%的NaNO₂溶液，搅拌反应30min得到重氮盐溶液；再将10mL含60mg载体蛋白的0.2mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液加入到重氮盐溶液中，继续反应3h；10000g离心5min，取上清，放于0.1mol/L pH7.4 PBS中透析，得到DMP人工抗原。

3.根据权利要求2所述的分泌邻苯二甲酸二甲酯单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于：所述的载体蛋白为BSA或OVA，相应得到的DMP人工抗原为DMAP-BSA或DMAP-OVA。

4.一种检测邻苯二甲酸二甲酯的间接竞争ELISA方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）试剂1用试剂2稀释至0.5μg/mL，100μL/孔包被酶标板，空白对照孔加100μL试剂2，4℃过夜；

（2）每孔加入200μL试剂3，摇晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，每孔加入250μL试剂4，放于37℃ 1h；

（3）每孔加入200μL试剂3，摇晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，按如下处理加样：1）DMP标准品：用试剂5梯度稀释的不同浓度的DMP标准品50μL，2）检测样品：用试剂5溶解的检测样品50μL，3）阳性对照：50μL试剂5；各处理分别再加入50μL试剂6，放于37℃ 1h； 

（4）每孔加入200μL试剂3，摇晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，每孔加入100μL试剂7，放于37℃ 1h；

（5）每孔加入200μL试剂3，摇晃90s，倒出孔内液体，拍干，重复3次后，新鲜配制试剂8，100μL/孔加入酶标板，室温避光25min；

（6）每孔加50μL试剂9，终止反应，用酶标仪测定492nm处的吸光值；

（7）以DMP标准品的浓度对数log[c]为横坐标（X），对应的抑制率I（%）为纵坐标（Y），可得一条Y=bX+a直线，抑制率I（%）通过如下公式计算得到：

式中：A为阳性对照孔的吸光值，A_i为含有浓度i的DMP孔的吸光值，A₀为空白对照孔的吸光值；

根据检测样品的吸光值计算抑制率Y，代入直线，可得X，取反对数，即可得出检测样品中DMP的浓度；

上述步骤中试剂1-9分别为：人工抗原DMAP-OVA，0.05mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液，含0.05% Tween-20的PBS；1%卵清蛋白，含1%牛血清白蛋白的PBS，DMP单克隆抗体，HRP标记的羊抗小鼠IgG，OPD显色剂，2mol/L H₂SO₄。