[发明专利]一种检测邻苯二甲酸二甲酯的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及一种简便、费用低廉、快速灵敏检测邻苯二甲酸二甲酯(DMP)的免疫学方法及试剂盒。

背景技术

邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，又称1,2-苯二甲酸二甲酯，酞酸二甲酯，英文名是Dimethyl phthalate，分子式C₁₀H₁₀O₄，分子量为194.19，密度为1.191g/mL。DMP是一种无色透明，微黄色油状的液体，稍微有点芳香味，其沸点为283.7℃，能与乙醇、乙醚等一般有机溶剂混溶，不溶于水和石油醚。邻苯二甲酸酯类与塑料分子的相容性很好，它们之间由氢键或范德华力连接，彼此保留各自相对独立的化学性质，常常作为增塑剂广泛应用于食品包装、医疗设备制造、建筑装修、农业用品等生活的各个领域，随着使用时间由塑料转移到环境中，造成空气、水和土壤的污染。美国环保局(EPA)将6种邻苯二甲酸酯类(PAEs)类化合物列入129种重点控制的污染物名单中，包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)和邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)，我国环境优先污染物黑名单中也包括3种PAEs化合物：邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)。

我国食品接触材料中DMP的使用限量为3％，仅能用于非接触、非脂肪性食品的材料，不得用于接触婴幼儿食品用材料。我国对食品塑料包装材料进行提取、净化后经气相色谱-质谱联用(GC-MS)测定，采用特征选择离子监测扫描模式检测，DMP最低可检出0.05mg/kg。贾丽等运用高效液相色谱法(HPLC)测定邻苯二甲酸二甲酯，用乙醇提取样品中的邻苯二甲酸酯类，再用乙腈-水作为淋洗液，测定DMP的检出限为0.14μg/L。

目前，国内外对DMP的监测方法主要是色谱法，包括气相和液相色谱法，此外，还有色谱-质谱的联用技术。虽然这些方法都能精确地检测DMP的含量，但此法对仪器条件要求高，前处理的操作相对复杂、耗时也较长。现已有基于多克隆抗体的PAEs免疫检测研究，但多克隆抗体的制备受动物免疫时间、免疫批次限制而不能无限量生产。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分泌DMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明的目的还在于提供一种检测DMP的间接竞争ELISA方法及试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种分泌DMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，通过包含如下步骤的方法制备得到：

(1)取用DMP人工抗原免疫BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞悬液混合。

(2)离心弃上清，加入PEG使细胞融合，再加入1640培养基终止PEG的作用；重复该步骤。

(3)离心弃上清，加入HAT培养基，铺至细胞板中进行培养。

(4)融合后第7天观察，标出有融合细胞的孔，记录位置和克隆数，补加HAT培养基；2周后，用HAT培养基全量换液，待细胞长至板底1/10时做检测。

(5)选择效价最高的并且对DMP具有特异性的阳性细胞进行克隆，克隆化结束后，建株得到分泌DMP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

步骤(1)中所述的DMP人工抗原优选通过包含如下步骤的方法制备得到：

1)半抗原的合成

往10mL甲醇中加入10g 4-硝基邻苯二甲酸，搅拌下加入1mL浓硫酸(98％)作催化剂，120℃回流7h。反应结束后，继续升温，蒸出剩余的甲醇。抽滤除去催化剂，得到粗产品。粗产品用氢氧化钠中和，减压蒸馏收集180～185℃/7.3kPa的馏分，得到纯净的4-硝基邻苯二甲酸二甲酯。用甲醇作溶剂，溶解4-硝基邻苯二甲酸二甲酯，按照每3mmol 4-硝基邻苯二甲酸二甲酯加0.05g钯碳的比例加入钯碳，加氢气还原24小时。除去未参加反应的钯碳和甲醇，得到4-氨基邻苯二甲酸二甲酯(DMAP)晶体。

2)人工抗原的合成